氧化型低密度脂蛋白对外周血单核来源树突状细胞成熟及免疫功能的影响

目的 观测氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对外周血单核来源的树突状细胞(DC)成熟及功能的影响,初步探讨其作用机理.方法 体外分离培养外周血单核来源的DC,按照处理方式不同分为4组,分别给予磷酸缓冲液(PBS)、低密度脂蛋白(LDL)、ox-LDL、肿瘤坏死因子a(TNF-a)刺激.随后进行流式细胞分析各组DC表面分子的表达情况.使用ELISA方法对培养上清中DC分泌的细胞凶子和趋化因子进行测定.使用FITC标记的葡聚糖检测DC吞噬抗原能力变化.使用Western blot方法对DC胞质内核冈子kB(NF-kB)、NF-kB抑制蛋白a(IkBa)的表达进行测定.结果 同空白对照组相比,经过ox-LDL处理后的外周血单核来源DC表达CIMO(22.3%比45.6%)、CD86 (25.9%比82.4%)均明显高,白介素12(31.43 pg/ml比126.73 pg/m1)、单核细胞趋化蛋白1(59.6ng/ml比116.3 ng/ml)分泌多,单核细胞炎性蛋白(MIP1)分泌无明显变化.同时处理后的DC抗原吞噬能力低(46.8%比10.7%),激活自体淋巴细胞增殖能力强(刺激指数4.5比5.7),免疫蛋白印迹实验表明,经ox-LDL处理后DC胞质IkBa的降解多,NF-kB表达高.结论 ox-LDL可以促进外周血单核来源的DC成熟,其机制与NF-kB抑制蛋白IkBa降解有关.     

阿托伐他汀对氧化低密度脂蛋白诱导兔脂肪细胞表达凝血和纤溶因子的调节

目的探讨阿托伐他汀对氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导兔脂肪细胞分泌组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的影响。方法取正常兔脂肪组织分离培养脂肪细胞,实验设对照组、ox-LDL干预组、阿托伐他汀干预组及联合干预组,除对照组外,其余3组分别以不同终浓度的ox-LDL和阿托伐他汀进行单独或联合干预,孵育24h。用酶联免疫吸附法检测TF和PAI-1蛋白含量。逆转录聚合酶链反应测定脂肪细胞TF和PAI-1 mRNA表达。结果ox-LDL使脂肪细胞分泌TF和PAI-1显著增加,TF和PAI-1 mRNA表达升高,并呈剂量依赖性。阿托伐他汀呈浓度依赖性地抑制兔脂肪细胞TF下和PAI-1 mRNA表达及蛋白产生。联合干预组与ox-LDL组比较,阿托伐他汀使TF和PAI-1 mRNA表达及蛋白分泌降低,但仍高于对照组。结论阿托伐他汀对ox-LDL诱导的兔脂肪细胞表达凝血和纤溶因子异常具有显著的调节作用。     

氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的机制及雌激素保护作用

<正>血管内皮细胞是血管壁的主要屏障,其功能失调和损伤是动脉粥样硬化的始动环节。氧化低密度脂蛋白(oxidized-low density lipoprotein,ox-LDL)对内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化发生和发展的重要因素[1]。内皮细胞作为雌激素的靶点,大量动物和体外实验证明,雌激素对内皮细胞起保护作用[2]。然而,心脏与雌孕激素替代研究和妇女健康行动研究2个多中心临床试验的数据显示,雌孕激素替代治疗增加绝经后妇女冠心病、静脉血栓栓塞及乳腺癌的发生[3]。鉴于雌激素对心血管系统作用的复杂性,人们一方面     

氧化型低密度脂蛋白对胎盘生长因子及抑制剂的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对胎盘生长因子1(PLGF-1)作用人脐静脉内皮细胞(ECV-304)释放炎性因子和内皮细胞黏附分子的影响,及PLGF-1拮抗剂2’-氨基-3’-甲氧黄酮(PD98059)对其抑制程度。方法应用不同浓度的PLGF-1(20、40、80μg/L)孵育ECV-304,分为对照组和PLGF-1干预组(20、40、80 μg/L)。再应用PD98059(100μmol/L)和PLGF 1(80 μg/L)刺激ECV 304,分为空白对照组、ox-LDL组、PLGF-1+ox-LDL组和PLGF-1+ox-LDL+PD98059(拮抗组)。应用ELISA法检测炎性因子和内皮细胞黏附分子的表达。结果 (1)PLGF-1诱导炎性因子和内皮细胞黏附分子的表达呈时间依赖关系,6 h达最理想的分泌量。随着PLGF-1浓度的加大呈上升趋势。(2)与空白对照组比较,ox-LDL组、PLGF-1+ox-LDL组和拮抗组白细胞介素6、基质金属蛋白酶2、可溶性细胞间黏附分子1、可溶性血管细胞黏附分子1的表达显著增加(P<0.01),拮抗组较PLGF-1+ox-LDL组的表达显著减少(P<0.01)。结论 PLGF-1可促使内皮细胞产生大量炎性因子,参与诱导内皮活化;抑制PLGF-1的生物活性可控制炎性的反应。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞LOX-1的表达及卡托普利的干预

目的:探讨应用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)培养的单核巨噬系细胞株U937细胞表面氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达的情况,并进一步探讨卡托普利对其表达的影响。方法:应用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞表面LOX-1的表达。结果:细胞在Ox-LDL培养后LOX-1的表达明显增加(P<0.05),并且随着作用时间的延长和浓度的增加,其表达呈先递增后递减变化,在浓度为100μg/ml,时间为24h时达高峰(0.965±0.413),应用LOX-1阻断剂PIA、角叉菜胶和卡托普利干预后其表达明显减少(P<0.05),结果分别为(0.083±0.024),(0.075±0.019),(0.084±0.025)。结论:Ox-LDL可诱导U937细胞表面LOX-1蛋白质的表达,卡托普利可通过抑制LOX-1的表达,从而抑制Ox-LDL对U937细胞的损伤,起到抗动脉粥样硬化的作用。     

辛伐他汀对氧化型低密度脂蛋白诱导的猪冠状动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的观察辛伐他汀对氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导的猪冠状动脉平滑肌细胞(SMC)增殖和迁移的影响。方法采用体外猪冠状动脉SMC培养技术,以3H-TdR的参入量表示冠状动脉的SMCDNA合成情况,应用划线方法测定冠状动脉SMC的迁移距离,观察辛伐他汀对OX-LDL诱导的冠状动脉SMC增殖和迁移的影响。结果浓度为10-8~10-5mol/L的辛伐他汀可使猪冠状动脉SMC的3H-TdR参入量减少,与对照组相比差异具有统计学意义;且药物浓度越高,参入量越少。10-8~10-5mol/L辛伐他汀均可使猪冠状动脉SMC的迁移距离减少,与对照组相比差异具有统计学意义。结论辛伐他汀可剂量依赖性地抑制OX-LDL诱导的猪冠状动脉SMC的增殖和迁移。     

氧化型低密度脂蛋白和α-类脂酸对血管平滑肌细胞中诱生型一氧化氮合酶基因表达的影响

目的　探讨氧化型低密度脂蛋白 (oxidizedlowdensitylipoprotein ,oxLDL)及抗氧化剂α 类脂酸对大鼠血管平滑肌细胞中L 精氨酸 一氧化氮系统的影响。方法　白细胞介素 1β诱导体外培养的血管平滑肌细胞表达诱生型一氧化氮合酶 (induciblenitricoxidesynthase ,iNOS)并产生一氧化氮 ,然后用不同浓度和氧化程度的oxLDL及α 类脂酸进行干预。逆转录 聚合酶链反应法检测血管平滑肌细胞中iNOSmRNA表达量 ,硝酸还原酶法测定一氧化氮含量。结果　oxLDL降低血管平滑肌细胞中iNOSmRNA的表达并减少一氧化氮的产量 ;iNOSmRNA表达及一氧化氮产量与oxLDL的浓度和氧化程度呈负相关 ;预先经α 类脂酸处理后能减轻oxLDL的上述抑制作用。结论　oxLDL显著抑制血管平滑肌细胞中L 精氨酸 一氧化氮系统 ,这一抑制效应与它的浓度和氧化程度有关。α 类脂酸能减轻oxLDL的上述作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体α诱导内源性成纤维细胞生长因子21表达水平变化对氧化修饰的低密度脂蛋白引起的鼠内皮细胞凋亡的影响

目的 通过观察氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)引起心脏血管内皮细胞损伤时,内源性成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因表达及蛋白分泌水平的变化,以及过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)刺激内源性FGF21生成增加时,对ox-LDL诱导细胞凋亡的影响,探讨内源性FGF21对动脉粥样硬化早期内皮功能的保护作用.方法 分离并培养成年Wistar大鼠心脏微血管内皮细胞,给予ox-LDL溶液,建立心脏血管内皮细胞损伤模型,以实时(real time)PCR及ELlSA法分析FGF21基因及蛋白水平变化,并给予PPARα配基苯扎贝特(分为50、100及200μmol/L组),诱导FGF21高表达,ELISA法观察细胞凋亡情况.结果 10、50及100μg/ml ox-LDL溶液组,FGF21基因表达及蛋白分泌越来越高.50及100 μg/ml ox-LDL组FGF21 mRNA表达水平,100 μg/ml ox-LDL组FGF21蛋白分泌水平,200 μmol/L苯扎贝特组诱导FGF21水平均显著高于溶剂对照组(P均＜0.05).200 μmol/L苯扎贝特+100μg/ml ox-LDL组细胞凋亡水平显著低于100 μg/ml ox-LDL组(P＜O.05).结论 ox-LDL诱导心血管内皮细胞损伤时FGF21分泌水平可反应性增高,且呈剂量依赖性.PPARα配基苯扎贝特可引起FGF21表达水平增高,对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡起到一定的抑制作用,提示FGF21可能作为一种心血管内源性保护因子,拮抗动脉粥样硬化早期心血管内皮功能障碍.     

氧化型低密度脂蛋白致PC12细胞的毒性作用及抗氧化剂的细胞保护作用

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)致PC12细胞的毒性作用及白藜芦醇等抗氧化剂的细胞保护作用。方法 通过噻唑蓝(MTT)实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验、DNA断端原位末端标记法(TUNEL)实验及caspase-3测定来观察oxLDL对PC12细胞存活率、细胞膜通透性、细胞核及caspase-3活性的影响。抗氧化剂白藜芦醇、丙丁酚及维生素E预处理细胞,再加入不同浓度oxLDL,观察抗氧化剂的细胞保护作用。结果 PC12细胞存活率随着ox-LDL浓度及作用时间增加而下降;LDH释放率、TUNEL阳性细胞数及caspase-3活性随着浓度增高而增高;低密度脂蛋白(LDL)对上述各项指标无影响。白藜芦醇、丙丁酚及维生素E均能减缓oxLDL所致的细胞存活率下降、LDH释放率的升高、TUNEL阳性细胞数的增加,其中白藜芦醇作用最强;白藜芦醇、丙丁酚减缓oxLDL所致的caspase-3活性增高,而维生素E对caspase-3活性无影响。结论oxLDL导致PC12细胞死亡,其浓度与PC12细胞存活率呈剂效关系,其作用时间与PC12细胞成活率呈时效关系。     

基质细胞衍生因子-1及其受体对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的研究基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与凋亡的影响。方法选用体外培养的大鼠主动脉VSMC,并分为正常对照组、ox-LDL组[动脉粥样硬化(AS)模型]、SDF-1组(AS模型+SDF-1)、SDF-1+12G5组(AS模型+SDF-1+CXCR4单克隆抗体)和12G5组(AS模型+CXCR4单克隆抗体),应用MTT法测VSMC细胞增殖,TUNEL法测细胞凋亡率,RT-PCR法测凋亡基因bax、bcl-2mRNA的表达。结果ox-LDL组的增殖率0.38±0.01,明显高于正常对照组0.28±0.02(P<0.01),明显低于SDF-1组0.44±0.02(P<0.01),与SDF-1+12G5组和12G5组比较差异无显著性(P>0.05);ox-LDL组的凋亡率24.2±2.4,高于正常对照组19.8±2.7和SDF-1组20.7±2.8(P<0.05),而与SDF-1+12G5组和12G5组比较差异无显著性(P>0.05);ox-LDL组bcl-2和bax的比值明显低于正常对照组和SDF-1组(P<0.01),而与SDF-1+12G5组和12G5组差异无显著性(P>0.05)。结论SDF-1可明显促进ox-LDL诱导的VSMC增殖,并抑制细胞凋亡;SDF-1及其受体CXCR4构成的生物学轴可能通过bcl-2/bax途径影响VSMC凋亡。     

氧化低密度脂蛋白对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的　观察氧化低密度脂蛋白(ox LDL)对外周血内皮祖细胞(EPC)数量和功能的影响。方法　密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞并加入不同浓度ox LDL(分别为25,50,100,200μg/ml)和LDL(100μg/ml)培养一定的时间(6、12、24和48h)。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPC,分别观察EPC的增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力。结果　Ox LDL显著减少外周血EPC数量,200μg/mlox LDL作用24h对EPC数量的影响最为显著(较对照组减少了近70%,P<0.01)。另外,100μg/mlox LDL呈时间依赖关系减少EPC数量,于24h达到高峰(P<0.01)。Ox LDL也显著损害了外周血EPC的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论　Ox LDL可减少EPC数量并损害EPC功能。     

维生素E对氧化型低密度脂蛋白引起的人脐静脉内皮细胞毒性及增殖的影响

目的 探讨抗氧化剂维生素E(VitE)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)毒性作用及增殖的影响.方法 以乳酸脱氢酶(LDH)及3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入,分别测定HUVEC的损伤和增殖.结果 VitE可明显抑制高浓度(＞200 μg/L)ox-LDL引起的内皮细胞释放乳酸脱氢酶(LDH),并能有效抑制低浓度(＜200 μg/L)ox-LDL引起的HUVEC 3H-TdR、3H-Leu的掺入,二者均具有剂量依赖性.结论 抗氧化剂VitE对ox-LDL引起的内皮细胞损伤有保护作用,对其引起的增殖有抑制作用,这对预防动脉粥样硬化及再狭窄的形成具有重要意义.     

吡格列酮和胰岛素对内皮祖细胞增殖和凋亡及分泌一氧化氮的影响

目的观察吡格列酮和胰岛素对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)的增殖能力、凋亡及分泌NO能力的影响,并探讨其机制。方法取正常SD大鼠32只,随机分为吡格列酮组和非吡格列酮组,各16只,分别给予吡格列酮和生理盐水灌胃预处理。喂养10天后,断颈处死,密度梯度离心法取骨髓单个核细胞,在M199培养液中培养扩增EPCs并进行鉴定。贴壁细胞培养4天后,将吡格列酮组EPCs消化后进一步分为两组,分别给予胰岛素(1nmol/L)或空白干预,非吡格列酮组EPCs处理同吡格列酮组EPCs。24h后检测NO水平,3天后检测凋亡情况,7天后检测细胞增殖能力。结果吡格列酮预处理能提高EPCs数量(P<0.01),吡格列酮预处理和(或)体外给予胰岛素干预组EPCs与未处理组细胞相比EPCs增殖能力提高(P<0.01),凋亡程度降低(P<0.05),培养上清中NO浓度增加(P<0.05)。结论体内吡格列酮预处理与体外胰岛素干预均能促进EPCs增殖,抑制EPCs凋亡,并促进EPCs分泌NO,且两种药物联合应用具有协同作用。     

慢病毒介导的PIM-1基因调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖和对凋亡的影响

目的:观察PIM-1基因调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的增殖和对凋亡的影响。方法:应用流式细胞仪(FCM)分别对第4代(P4)BMMSCs表面抗原CD29、CD44和CD45进行鉴定。实验分为空白对照组(对照组)、EGFP转染组(EGFP组)、PIM-1基因转染组(PIM-1组),将成功构建的慢病毒载体LV-egfp-PIM-1及LV-egfp转染至BMMSCs中,采用PCR法检测慢病毒载体转染后PIM-1表达的变化,用Western blot法检测慢病毒载体转染后PIM-1蛋白表达水平,用MTT比色法检测PIM-1对BMMSCs增殖能力的调控作用,FCM检测PIM-1对BMMSCs凋亡的影响。结果:大鼠BMMSCs成功转入PIM-1基因后,与对照组相比,PIM-1蛋白的表达显著增加(P0.01),细胞增殖能力显著增加(P0.01),细胞凋亡率则显著降低(P0.01)。结论:过表达PIM-1可显著提高BMMSCs的增殖能力和抑制BMMSCs凋亡。     

内皮素-1对大鼠骨髓内皮前体细胞增殖、细胞周期及NO分泌功能的影响

目的探讨内皮素-1（ET-1）对大鼠骨髓内皮前体细胞（EPC）增殖、细胞周期及一氧化氮（NO）分泌功能的影响。方法采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单核细胞,在M199培养液中培养扩增EPC并进行鉴定。不同浓度ET-1（A组:0mol/L、B组:10-9mol/L、C组:10-8mol/L、D组:10-7mol/L、E组:10-6mol/L）作用于EPC,MTT法检测ET-1对EPC增殖能力的影响,流式细胞仪检测ET-1对EPC细胞周期的影响,硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO含量的变化,观察ET-1对EPC的NO分泌功能的影响。结果与对照组（A组,0.405±0.017）相比,ET-1浓度C组（0.434±0.016）、D组（0.463±0.016）、E组（0.473±0.015）EPC增殖能力显著增高（n=8,P<0.01）。EPC的G0/G1期细胞百分数C组（57.28±3.65）%、D组（44.99±3.19）%、E组（40.29±3.74）%较对照组（70.55±1.37）%明显降低（n=5,P<0.01）,EPC的S期细胞百分数C组（26.75±2.87）%、D组（32.79±2.41）%、E组（35.74±2.94）%较对照组（20.04±1.64）%明显升高（n=5,P<0.01）,EPC的G2/M期细胞百分数C组（15.96±1.71）%、D组（22.22±2.22）%、E组（23.64±2.86）%较对照组（9.41±0.81）%明显升高（n=5,P<0.01）。EPC培养液中NO含量（μmol/L）ET-1浓度C组（11.70±1.80）、D组（15.69±1.86）、E组（16.89±1.55）较对照组（7.45±2.41）明显增加（n=8,P<0.01）。B组检测结果与对照组相比,各项指标均无统计学差异。结论ET-1能够促进EPC的增殖,促进细胞向S期和G2期的转化,并提高细胞NO分泌功能,可能参与缺血性疾病的血管再生过程。     

血管紧张素Ⅱ对骨髓源内皮祖细胞增殖能力的影响及机制的探讨

目的研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨髓源内皮祖细胞(EPCs)增殖能力的影响,并探讨其可能机制。方法通过密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,进行诱导分化,培养7天获得EPCs。抗AC133与抗血管内皮生长因子受体对EPCs双标后进行激光共聚焦鉴定。收集贴壁细胞加入不同浓度AngⅡ(10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)进行干预,MTT法观察EPCs增殖能力的变化,并利用RT-PCR法观察不同浓度AngⅡ干预及缬沙坦、蛋白激酶C(PKC)抑制剂预处理后EPCs的Flk-1 mRNA表达量的变化。结果在血管内皮生长因子(VEGF)存在的前提下,AngⅡ可以增强EPCs的增殖能力,并可以上调Flk-1 mRNA的表达。缬沙坦、抑制剂可以显著抑制AngⅡ的这种作用。结论AngⅡ可以通过1型受体、PKC通路上调EPCs的Flk-1,在VEGF的作用下促进其增殖,从而有助于血管新生。     

激活视黄醇类X受体对氧化型低密度脂蛋白诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7向树突样细胞分化的影响

目的探讨激活核受体视黄醇类X受体（RXR）对氧化型低密度脂蛋白（ox—LDL）诱导巨噬细胞向树突状细胞分化的影响及其机制。方法小鼠巨噬细胞系RAW264．7经ox-LDL诱导48h后分化为树突样细胞,相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标志物,CM-H2DCFDA荧光探针测定细胞内活性氧浓度。结果ox—LDL诱导48h后,表达与树突状细胞免疫成熟和激活有关的细胞表面标志物CIMO、CD86、CD83、MHCClassⅡ和CD1d的RAW264．7细胞比例明显升高,同时给予天然型RXR特异性配体9-cisRA（10^-7mol／L）上述比例分别下降约47％、43％、48％、32％和17％,同时给予合成型RXR特异性配体SR11237（10^-6mol／L）上述比例分别下降约38％、38％、46％、36％和32％,并且均表现剂量依赖性。相差显微镜观察发现树突样细胞形态改变也得到部分抑制。ox-LDL引起细胞内活性氧浓度显著升高[平均荧光强度（MFI）38．24±4．20比4．46±0．39,P〈0．05],同时给予9．cisRA（10.mol／L）或SR11237（10^-6mol／L）MFI分别降低到12．60±1．52和17．89±1．91,较ox-LDL单独处理组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论激活核受体RXR能够部分抑制ox-LDL诱导巨噬细胞向树突状细胞分化,其机制可能与减轻细胞氧化应激损伤有关。     

犬骨髓成年多能祖细胞诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的内皮细胞移植对损伤组织的修复治疗至关重要,本研究旨在探讨骨髓成年多能干细胞(MAPCs)体内外诱导分化血管内皮细胞的可行性.方法采用Percoll密度梯度法分离培养MAPCs.应用10 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)对骨髓MAPCs进行体外诱导分化2～3周,使其定向分化成为血管内皮细胞.采用细胞形态学、细胞免疫组化以确定诱导分化的效果.将标记BrdU的MAPCs自体移植于犬心肌内,观察局部微环境对于骨髓MAPCs的分化能力.结果应用10 ng/ml VEGF孵育骨髓MAPCs 2～3周,可见MAPCs分化为血管内皮细胞:细胞形态呈鹅卵石样;形成血管样结构;细胞vWF免疫染色阳性.移植于心肌内的MAPCs在体内形成新生血管,血管内皮BrdU染色与vWF染色均阳性.结论骨髓MAPCs可在体外VEGF诱导下或在体内微环境作用下分化为成熟血管内皮细胞.骨髓MAPCs可为损伤组织的移植修复治疗提供内皮细胞资源.