睾酮对3T3-L1脂肪细胞促酰化蛋白受体及下游信号蛋白的影响

目的:观察睾酮对3T3-L1(前)脂肪细胞促酰化蛋白(ASP)受体C5L2-mRNA和细胞表面C5L2蛋白表达的影响,以及睾酮对3T3-L1(前)脂肪细胞Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白以及ASP刺激的Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达的影响。方法:体外培养3T3-L1细胞,诱导细胞分化,用不同浓度睾酮作用于3T3-L1(前)脂肪细胞,孵育过夜后收获细胞,采用RT-PCR和流式细胞仪检测ASP受体mRNA和蛋白表达情况;采用Western Blot法检测基础状态和ASP刺激的Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。结果:睾酮呈浓度依赖性均抑制3T3-L1成熟脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白的表达,10-6mol/L时mRNA和蛋白分别减少了60%(P<0.01)和27%(P<0.01)。但前脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白表达水平均无显著性差异。高浓度(10-6mol/L)睾酮在一定程度上抑制ASP刺激的成熟脂肪细胞Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ的表达,分别减少了52%(P<0.05),27%(P>0.05),50%(P<0.01)和57%(P<0.05);在前脂肪细胞,ASP-C5L2下游信号分子Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ表达无明显抑制作用。结论:睾酮抑制成熟脂肪细胞ASP信号分子表达,睾酮诱导ASP抵抗的发生机制与下调脂肪细胞表面ASP受体功能有关,与干扰ASP-C5L2信号转导途径有关。ASP抵抗参与了高睾酮引起的胰岛素抵抗状态的病理生理过程,ASP抵抗可能参与多囊卵巢综合征(PCOS)、肥胖症等多种疾病的病理生理过程。     

氯沙坦改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的机制研究

目的探讨氯沙坦改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的主要作用机制。方法以地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞,建立胰岛素抵抗细胞模型,根据细胞模型添加干预药物的不同分为模型对照组（不添加任何药物）、氯沙坦组（分别给予1、10、100μmol/L氯沙坦干预48 h）和wortmannin＋氯沙坦组,wortmannin＋氯沙坦组以100 nmol/L的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特异性抑制剂wortmannin预处理20 min后再加入100μmol/L氯沙坦干预48 h。观察脂肪细胞体积的变化,采用葡萄糖氧化酶法检测细胞培养上清液中葡萄糖的浓度,采用Western blotting分析脂肪细胞中PI3K和胰岛素受体底物1（IRS-1）的表达以及IRS-1丝氨酸磷酸化水平。结果与模型对照组比较,氯沙坦组脂肪细胞体积明显缩小（P〈0.01）,细胞培养上清液中葡萄糖的浓度显著降低（P〈0.01）,PI3K和IRS-1表达明显上升（P〈0.01）,IRS-1丝氨酸磷酸化水平显著下降（P〈0.01）但可被wortmannin阻断。结论氯沙坦可使3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的细胞体积缩小,并增加细胞对葡萄糖的利用,其机制可能与PI3K信号通路有关。     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

促酰化蛋白对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响

目的 观察胰岛素抵抗状态下3T3-L1成熟脂肪细胞促酰化蛋白（acylation stimulating protein,ASP）刺激下脂代谢关键酶（LPL、HSL、perilipin、DGAT）基因表达的影响,以及胰岛素经典信号通路（IRS-1、PI₃K）蛋白表达的影响。方法 3T3L-1脂肪细胞给予不同浓度（0、0.125、0.5、1.0mmol/L）油酸及棕榈酸孵育过夜。real-time PCR方法定量检测ASP刺激下脂肪细胞LPL、HSL、perilipin、DGAT基因表达水平。Western blot法检测ASP和INS刺激下脂肪细胞HSL、perilipin、IRS-1、PI₃K蛋白表达水平。结果 ASP促进脂代谢关键酶HSL、LPL、perilipin和DGAT的基因表达。其中0.5mmol/L油酸组增加5倍HSL、1.87倍LPL、6.87倍perilipin、2.5倍DGAT基因表达（P<0.01）。1.0mmol/L油酸组增加3.26倍HSL、2.98倍LPL、5.46倍perilipin、2倍DGAT基因表达（P<0.01）。0.5mmol/L棕榈酸组增加1.98倍HSL、4.63倍DGAT基因表达（P<0.05）。胰岛素和ASP刺激下显著增加脂肪酸孵育的成熟脂肪细胞HSL、perilipin、PI₃K蛋白的表达。胰岛素刺激状态下油酸组增加1.75倍HSL、1.27倍perilipin、2.59倍PI₃K蛋白的表达（P<0.01）,棕榈酸组增加85%（P<0.05） HSL、96%（P<0.05） perilipin、3.66倍（P<0.01） PI₃K蛋白的表达。ASP刺激状态下油酸组增加76%（P<0.05） HSL、86%（P<0.05） perilipin蛋白的表达,棕榈酸组增加76%（P<0.05） perilipin、1.27倍（P<0.01） PI₃K蛋白表达。胰岛素及ASP刺激下脂肪细胞IRS-1蛋白表达差异无统计学意义。结论 胰岛素和ASP可增加脂代谢关键酶HSL、perilipin蛋白及经典胰岛素信号通路PI₃K蛋白的表达。ASP可以从不同程度上增加糖脂代谢关键酶HSL、LPL、perilipin和DGAT基因的表达,通过增加这些酶的表达,提高酶的敏感度,参与调节脂肪细胞糖脂代谢。     

胰岛素抵抗患者前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立

目的 探索多囊卵巢综合征(PCOS)胰岛素抵抗(IR)患者的前脂肪细胞原代培养模型.方法 取PCOS IR患者腹部纯脂肪颗粒,采用改进的"贴壁-天花板"法,培养出梭形细胞,同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作对照,采用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)为主的脂肪细胞分化培养液,诱导前脂肪细胞的分化.结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高.经形态学动态观察、生长曲线及对IGF-1和地塞米松反应的测定证明其是功能活跃的前脂肪细胞,在体外重现了其增殖、分化的全过程.结论 采用改良"贴壁-天花板"法,能成功地培养出胰岛素抵抗患者前脂肪细胞;采用IGF-1取代胰岛素作为脂肪细胞分化培养液,可以诱导前脂肪细胞的分化.     

促酰化蛋白对3T3-L1脂肪细胞炎性反应的影响

目的 观察3T3-L1成熟脂肪细胞胰岛素抵抗状态下促酰化蛋白(acylation stimulating protein,ASP)对炎性因子(IL-6、MCP-1、MIP-1α和TNF-α)分泌水平以及炎性信号因子(JNK1、IKKβ)蛋白表达的影响。 方法 3T3-L1成熟脂肪细胞分别给予不同浓度(0、0.125、0.5、1.0mmol/L)油酸(C18∶ 1)或棕榈酸(C16∶ 0)温育过夜,诱导胰岛素抵抗,在此基础上给予ASP刺激,用ELISA测定IL-6、MCP-1、 MIP-1α和TNF-α 4种细胞炎性因子的分泌水平,采用Western blot法检测JNK1和KKβ蛋白表达。 结果 油酸诱导的胰岛素抵抗下,ASP刺激的脂肪细胞IL-6和MCP-1的分泌水平轻度下调,但差异无统计学意义;而ASP刺激的脂肪细胞MIP-1α和TNF-α的分泌水平显著下降,MIP-1α和TNF-α的分泌分别下调57%(P<0.05)和48%(P<0.05)(1.0mmol/L油酸组)。棕榈酸诱导的胰岛素抵抗下,ASP刺激的脂肪细胞IL-6分泌水平呈下降趋势,最大下调50% IL-6(P<0.05);22% MCP-1(P>0.05),35% MIP-1α(P>0.05)和38%TNF-α(P>0.05)的分泌。高浓度(1.0mmol/L) 油酸和棕榈酸诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗状态下,ASP刺激的炎性信号蛋白JNK1蛋白表达显著下调,分别为34%(P<0.05)和54%(P<0.01)。但IKKβ蛋白表达差异无统计学意义。 结论 在脂肪酸诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗状态下,ASP在一定程度上调节炎性因子分泌,参与调节JNK、IKK/NF-κB信号通路中重要信号分子的功能,ASP参与了脂肪细胞脂毒性-炎性反应的调控。     

GLP-1通过下调ATGL表达参与3T3-L1脂肪细胞脂质代谢

目的探讨胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对胰岛素抵抗模型3T3-L1 脂肪细胞的影响及其可能的机制。方法分别使用
GLP-1、胰岛素、胰岛素加GLP-1 干预胰岛素抵抗模型3T3-L1 脂肪细胞,Western blotting 检测脂肪组织甘油三酯水解酶
（ATGL）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、Akt1、Akt2 及其磷酸化蛋白表达量;免疫荧光法检测GLP-1 干预后脂肪细胞的成脂情
况。结果胰岛素刺激下3T3-L1脂肪细胞Akt1、Akt2活化不明显。GLP-1刺激下3T3-L1脂肪细胞磷酸化Akt1、Akt2表达明显
增加,同时促进GLUT4向细胞膜上转移,并抑制ATGL蛋白的表达。在胰岛素的协同作用下这一现象更加明显。结论GLP-1
通过降低脂肪细胞ATGL蛋白表达参与脂质代谢,同时增强脂肪细胞GLUT4的膜转移,促进葡萄糖吸收,改善胰岛素抵抗。
     

3T3-L1脂肪细胞诱导分化与肿瘤抑制因子PTEN的表达研究

目的 优化3T3-L1脂肪细胞分化条件,研究信号因子PTEN在分化过程中的表达,以了解PTEN是否通过表达量来调节正常脂肪细胞形成,为探索PTEN的药物靶标作用奠定基础.方法 DMEM高糖培养基培养3T3-L1脂肪前体细胞,地塞米松、3-异丁基1-甲基黄磦呤(IBMX)和胰岛素按2种组合方案分别诱导3T3-L1细胞分化,油红O染色鉴定脂肪细胞,蛋白裂解液提取细胞总蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分化过程中PTEN的表达量,用生物信息学进行小鼠和人类PTEN的同源性分析.结果 1 μmol/L地塞米松、0.5 μmol/L mMX和5 μg/ml胰岛素诱导48 h后,再用含5 μg/ml胰岛素的DMEM高糖营养液培养48 h的方案对3T3-L1细胞诱导分化效果较好,脂肪细胞分化率高且均一,在分化第10天可见90%以上细胞分化为脂肪细胞.PTEN在脂肪细胞分化过程中表达量在第0、4 th、6 th、9 th和第12天时不一致,在12天时明显下降,显著低于诱导前.同源性比对分析表明,小鼠和人类的PTENmRNA编码序列匹配率为96%,而氨基酸序列匹配率为100%.结论 内源性PTEN在小鼠3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞的时相过程中表达量有所变化,提示PTEN可能在生理条件下即可发挥提高胰岛素敏感性和促进脂肪细胞形成的作用.     

PCOS患者AMH水平与肥胖、睾酮水平、胰岛素抵抗的相关性分析

目的比较BMI正常与否多囊卵巢综合征（PCOS）患者抗苗勒管激素（AMH）水平差异,分析AMH水平与患者内分泌及代谢指标的相关性。方法209例PCOS患者按BMI正常与否分为肥胖组（BMI≥25,77例）和正常体重组（BMI＜25,132例）。测定患者血清AMH、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮、空腹血糖和空腹胰岛素、TC、TG和LDL-C水平,计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）,比较两组患者AMH水平差异,并分析AMH水平与各临床指标的相关性。结果肥胖组患者AMH水平低于正常体重组[（8.92±4.70）ng/mlvs（10.99±5.40）ng/ml,P＜0.05],空腹血糖、空腹胰岛素、HORM-IR、TG、LDL-C水平均高于正常体重组（均P＜0.05）,LH、LH/FSH均低于正常体重组（均P＜0.05）。总PCOS组患者AMH水平与患者BMI、空腹胰岛素水平、HOMA-IR呈负相关,与LH、LH/FSH呈正相关,与睾酮不相关。肥胖组患者AMH水平与各临床指标均不相关,正常体重组患者AMH水平与LH/FSH、睾酮水平呈正相关。当控制BMI因素后,总PCOS组患者AMH水平与LH/FSH及睾酮水平呈正相关,与空腹胰岛素水平、HORM-IR不相关。结论肥胖和胰岛素抵抗可能使PCOS患者AMH水平降低;当控制BMI因素后,PCOS患者AMH水平与睾酮水平呈正相关,与胰岛素及HOMA-IR不相关。     

吡格列酮和白细胞介素-6对3T3-L1脂肪细胞Visfatin mRNA表达的影响

目的观察吡格列酮和白细胞介素-6(IL-6)对3T3-L1脂肪细胞Visfatin mRNA表达的影响。方法体外培养3T3-L1前体脂肪细胞并诱导其分化成熟,分别以不同浓度的吡格列酮和(或)IL-6干预,在不同的时间段提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术检测细胞中Visfatin mRNA的表达水平。结果IL-6和吡格列酮分别作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞均能下调Visfatin mRNA的表达,且用吡格列酮预处理或与IL-6共同作用均不能够改善IL-6对Visfatin mRNA的抑制作用。结论IL-6对Visfatin mRNA表达的负调控可能是其引起胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱的机制之一,Visfatin可能并不是噻唑烷二酮(TZD)类药物改善胰岛素敏感性的靶基因。     

葡萄糖和胰岛素对脂肪细胞内脂素表达的作用

 目的  观察脂肪细胞经不同浓度葡萄糖和胰岛素干预后内脂素表达的改变,探讨内脂素在糖尿病发病过程中的作用。 方法  培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化成成熟脂肪细胞。采用不同浓度葡萄糖、胰岛素孵育脂肪细胞48h,RT-PCR和western blot技术检测3T3-L1脂肪细胞中内脂素mRNA和蛋白的表达水平 结果  与对照组比较,随着葡萄糖浓度的增加,3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA和蛋白的表达量下降（P均＜0.05）;在不同浓度胰岛素作用下,3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA和蛋白的表达量改变无统计学意义（P＞0.05）。  结论  高糖状态可抑制体外培养的脂肪细胞内脂素的表达,胰岛素浓度的改变对内脂素表达无影响。     

2型糖尿病患者脂肪细胞胰岛素抵抗与微炎症的研究

目的:观察2型糖尿病患者脂肪细胞内胰岛素信号转导蛋白:胰岛素受体底物-1(Insulin receptor substrate-1,IRS-1)酪氨酸磷酸化及蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/AKT)ser473磷酸化水平以及微炎症因子白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)的表达.方法:取2型糖尿病患者(2型糖尿病组)及非糖尿病患者(非糖尿病对照组)腹部皮下脂肪组织原代培养,用免疫沉淀法及蛋白印迹法(Western blot)检测两组脂肪细胞内胰岛素刺激后IRS-1酪氨酸磷酸化及AKT-Ser473磷酸化程度,酶联免疫吸附法检测脂肪细胞培养液中IL-6蛋白的水平.结果:(1)2型糖尿病组脂肪细胞内胰岛素刺激后IRS-1酪氨酸磷酸化及AKT-Ser473磷酸化水平明显低于非糖尿病对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)2型糖尿病组脂肪细胞培养液中IL-6蛋白的水平明显高于非糖尿病对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:2型糖尿病患者脂肪细胞存在胰岛素抵抗和微炎症状态.     

3T3-L1脂肪细胞中高糖诱导胰岛素抵抗的分子机制

观察 3T3-L1脂肪细胞长期暴露到高浓度葡萄糖对糖的转运活动和胰岛素信号蛋白的表达及磷酸化的影响。结果表明 ,在 3T3 -L1脂肪细胞中高浓度葡萄糖 (10 ,15和 2 5mmol·L-1)培养 2 4h ,以一种剂量依赖的方式诱导基础的和胰岛素刺激的糖转运活动的减少。高糖降低了细胞内胰岛素受体底物 1(IRS1)的蛋白表达和它的酪氨酸磷酸化 ,而胰岛素受体底物 2 (IRS2 )蛋白表达呈明显的上调 ;对p85和PKB量无影响。 3T3 -L1脂肪细胞长期暴露到高浓度葡萄糖可以抑制糖的转运活动 ,诱导胰岛素抵抗。其作用机制与影响胰岛素信号肽的表达和酪氨酸磷酸化有关。     

简易胰岛素敏感性指数评估PCOS胰岛素抵抗

目的:寻求一个简单可靠的胰岛素敏感性指数用于评估多囊卵巢综合征(PCOS)患者胰岛素抵抗程度.方法:对47名PCOS患者(按BMI分为肥胖组和非肥胖组)和20名健康女性(正常对照组)行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)与Botnia钳夹术.结果:在三组行两两比较Botnia钳夹术获得的M值,均有统计学意义,全部P＜0.05,而肥胖组的M值最低.来源于OGTT的胰岛素抵抗指数SumaI与Botnia钳夹术获得的M值相关性好(r=-0.642,p＜0.001).结论:在评估PCOS患者胰岛素抵抗程度时,SumaI是个比较可靠的简易指数.     

醛固酮对3T3-L1脂肪细胞PTEN及p-Akt蛋白表达的影响

目的 观察胰岛素抵抗（IR）的脂肪细胞中Aktser473磷酸化（p-Akt）水平和与张力蛋白同源10号染色体缺失的磷酸酶基因（PTEN）蛋白的表达,以及醛固酮和螺内酯处理后上述蛋白表达的变化,从而探讨醛固酮在IR发病机制中的作用。方法 通过地塞米松与胰岛素共同诱导3T3 L1前脂肪细胞建立IR模型,western blots方法检测正常分化及IR的脂肪细胞PTEN蛋白和p-Akt水平,观察醛固酮和螺内酯对细胞PTEN蛋白表达及p Akt水平的影响。结果 IR脂肪细胞PTEN的蛋白水平较正常分化脂肪细胞显著升高［（0.83±0.11）vs（0.63±0.06）,P＜0.05］,高浓度醛固酮可增加PTEN蛋白表达,经螺内酯处理后PTEN蛋白表达明显下调（P均＜0.05）;IR脂肪细胞模型p-Akt水平明显低于正常分化脂肪细胞［（0.52±0.12）vs（0.78±0.12）,P＜0.05］,高浓度醛固酮可下调p-Akt水平,螺内酯可部分逆转醛固酮的抑制作用（P均＜0.05）。结论 醛固酮可能通过PI3K-AKT通路导致IR的发生。