绒癌耐药细胞系的建立及获得性耐药机制的研究

目的采用目前治疗绒癌最常用的药物诱导建立绒癌的耐药细胞系,比较不同药物引起耐药机制的差异.方法采用浓度梯度递增法和间歇诱导法,分别用5-FU,MTX,VP-16诱导绒癌细胞系JEG-3,建立相应耐药细胞系,采用MTT法测定耐药细胞系对5-FU、MTX、KSM、VP-16和Taxol的耐药指数,用RT-PCR测定亲本细胞及各耐药细胞系耐药相关基因如肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)、谷胱甘肽转移酶(GST-π)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和多药耐药基因(MDR-1)的mRNA表达,比较各种细胞生长曲线,细胞群体倍增时间.结果JEG-3细胞系在诱导耐药细胞前即有LRP、MRP、GST-π、DHFR的共表达,诱导耐药后上述各基因的表达无明显变化.诱导耐药前JEG-3细胞无MDR1的表达,用VP-16、5-FU间歇诱导的方法诱导形成的耐药细胞系有MDR-1表达,且耐药指数增加.结论JEG-3耐药细胞系耐药性的产生与MRP、LRP、GST-π、DHFR表达的关系不密切,而与MDR1的表达有关.     

绒毛膜癌耐药细胞系的建立及人白细胞介素2基因转染后对其多药耐药性的逆转作用

目的 建立绒毛膜癌（绒癌）的耐药细胞系,应用基因工程技术将人白细胞介素2（hIL-1) 基因导入绒癌耐药细胞系,观察hIL-2基因转染后对绒癌耐药细胞耐药性的逆转作用。方法 采用间歇诱导的方法,用鬼臼乙叉甙（VP－16）诱导绒癌细胞系JEG－3,建立耐药细胞系,四甲基偶氮唑蓝比色法检测该耐药细胞系对多种化学治疗药物的耐药指数,及多种耐药基因包括肺耐药蛋白、多药耐药相关蛋白、谷胱甘肽转移酶、二氢叶酸还原酶和多药耐药基因（MDR1）的mRNA表达情况。用逆转录聚合酶链反应技术,克隆hIL-2基因,将hIL-2基因插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,提取质粒,通过阳离子脂质体将hIL-2基因转染绒癌耐药细胞系,用新霉素筛选含hIL-2 DNA片段的单个细胞克隆,检测转染hIL-2基因后该细胞耐药指数的变化,测定转染后细胞hIL-2和多种耐药基因mRNA的表达。结果 用VP－16采用间歇诱导法,成功建立绒癌的VP－16耐药细胞系JEG－3／VP－16,并检测出MDR1 mRNA表达。转染hIL-2基因后,绒癌细胞中检测出hIL-2 mRNA表达,转染hIL-2基因的细胞的耐药指数降低,JEG－3／VP－16细胞转染pcDNA3.1( )-hIL-2后,对VP－16的耐药指数由38．7降至6．0－6．1,对甲氨蝶呤的耐药指数由14．5降至2．6－2．5,对更生霉素的耐药指数由13．0降至2．0;MDR1 mRNA表达转阴。结论 hIL-2基因转染后可通过调节MDR1的表达,从而逆转绒癌耐药细胞系的耐药性。     

6种常见耐药标志物在氟尿苷耐药绒癌细胞系构建过程中的动态表达

目的:通过检测对氟尿苷(FUDR)耐药的绒癌细胞系构建过程中肺耐药相关蛋白(LRP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、survivin、谷胱甘肽 S-转移酶-π(GST-π)、多药耐药基因(MDR1)和多药耐药相关蛋白基因(MRP)6种常见耐药标志物的动态表达,探讨其耐药机制并进行耐药标志物的初步筛选.方法:用化学发光法和荧光定量PCR技术,分别检测不同浓度FUDR诱导的JEG-3细胞中β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌量和上述6种常见耐药标志物在耐药细胞构建过程中的动态表达.结果:不同基因在药物诱导过程中的变化趋势不尽相同.只有LRP基因的表达随着诱导药物浓度和肿瘤细胞耐药性的增加而逐渐上调.结论:耐药的产生是分阶段的,不同阶段有不同的因素参与.就目前的研究结果而言,只有LRP的表达变化与FUDR诱导浓度和耐药性有明显正相关,提示其可以作为绒癌对FUDR耐药的候选预测指标.     

二氢叶酸还原酶在两种不同方式诱导的甲氨蝶呤耐药绒癌细胞系中的动态表达

目的:用间断和连续两种诱导方式建立对甲氨蝶呤(MTX)耐药的绒毛膜癌细胞系,并动态检测二氢叶酸还原酶(DHFR)在两种耐药细胞系建立过程中的表达。方法:采用间断和连续诱导法诱导人绒癌细胞系JeG-3,分别建立绒癌MTX耐药细胞系MTXA1(间断诱导浓度为1.1×10-3mol/L)和MTXC2(连续诱导浓度为1.1×10-5mol/L)。细胞计数法(CCK-8)观察耐药细胞的耐药指数;化学发光法和荧光定量PCR技术分别检测不同诱导方法和不同浓度MTX诱导的JeG-3细胞中β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌量和DHFR mRNA的表达水平。结果:(1)历时1年成功建立了绒癌耐药细胞系MTXA1和MTXC2,其耐药指数分别为21.36和28.84;(2)β-HCG分泌和DHFR mRNA表达水平在间断和连续两种不同诱导方式诱导的绒癌细胞株中呈相同的动态变化趋势:经低浓度MTX诱导后,JeG-3细胞中β-HCG分泌和DHFR mRNA的表达水平上调;但当MTX诱导浓度增加到一定剂量时,两者不再继续上调而呈下降趋势。结论:成功建立了间断和连续两种方式诱导的耐药绒癌细胞系MTXA1和MTXC2。绒癌细胞β-HCG分泌和DHFR mRNA的表达与MTX作用浓度以及耐药性无明显的正相关关系。目前的研究结果表明,DHFR mRNA的表达水平不适宜作为绒癌细胞是否对MTX耐药的指标。     

人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞系3AO/cDDP模型的建立及耐药机理的实验研究

目的：模拟临床卵巢上皮性癌化疗的用药特点建立顺铂耐药细胞系3AO／CDDP,检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopeⅡ表达。方法：以临床卵巢上皮性癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用大剂量顺铂（10μg／ml）反复间歇24h暴露法建立顺铂耐药细胞系;用FCM法检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopoⅡ表达。结果：历时4．5个月建成顺铂耐药株3AO／cDDP,耐药性稳定,耐药指数1．62,与临床耐药倍数相近。3AO／cDDP细胞MRP、P－gp表达与3AO相比无明显变化（P＞0．05）,LPR、GSTπ表达明显升高（P＜0．005及P＜0．05）,Tope-Ⅱ含量明显降低（P＜0．05）。结论：3A0／cDDP是模拟临床用药特点建立的、研究顺铂耐药的理想模型;顺铂耐药与LRP、GSTπ表达升高及TopoⅡ含量降低有关,与MRP、P-gp无关。     

内质网应激激活与依托泊甙和放线菌素D耐药绒癌相关性研究

目的探讨内质网应激激活与拓扑异构酶Ⅱα介导的依托泊甙(etoposide,VP16)和放线菌素D(actinomy-cin-D,Act-D)耐药绒癌的关系。方法采用间断诱导法诱导人绒癌细胞系JEG-3,分别建立绒癌ActD耐药细胞系JEG-3/ActDB1和VP16耐药细胞系JEG-3/VPC1。细胞计数法(cell counting kit-8,CCK-8)观察敏感细胞和耐药细胞的生长增殖规律和耐药指数;流式细胞仪检测细胞周期比例和染色体倍性变化;荧光定量PCR技术分别检测两种不同药物诱导的JEG-3耐药株中拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和内质网应激(ERS)各个通路相关的基因mR-NA的表达水平。结果 (1)成功建立了绒癌耐药细胞系JEG-3/ActDB1和JEG-3/VPC1。其耐药指数分别为50.64±10.68和65.87±3.19。耐药株生长速度均较亲本细胞减慢,三者的染色体倍性差异无统计学意义。(2)在两种不同的耐药株中,TopoⅡα的表达水平均明显低于亲本细胞,而与ERS各个通路相关基因均有不同程度的激活。结论成功建立了针对ActD和VP16耐药的绒癌细胞系JEG-3/ActDB1和JEG-3...     

人脐血间充质干细胞携带人肿瘤坏死因子α基因逆转绒癌耐药体外研究

目的观察人脐血间充质干细胞携带人肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因对绒癌耐药细胞株耐药指数的影响。方法应用AdMax系统构建携带TNF-α基因的腺病毒载体。鉴定、分离、培养、扩增、纯化人脐血间充质干细胞(hUCB-MSCs)。携带TNF-α基因的重组腺病毒感染hUCB-MSCs后,与绒癌耐药细胞株JEG3/VP16共培养,空载腺病毒(Ad-EGFP)感染的hUBC-MSCs做为对照,MTT法测定共培养48h后JEG-3/VP16对依托泊苷(VP16)、氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)耐药情况。结果(1)酶切、聚合酶链式反应(PCR)鉴定构建的重组腺病毒携带TNF-α基因。(2)重组腺病毒可高效感染hUCB-MSCs。(3)JEG-3/VP16和转染TNFa基因的hUCB-MSCs共培养,JEG-3/VP16对VP16、5-FU、MTX的IC50分别下降至未共培养前IC50的1/12.8,1/6.75和1/10.1。结论携带hTNFα基因的hUCB-MSCs与绒癌耐药细胞株JEG-3/VP16共培养后,逆转了JEG-3/VP16的耐药性。     

五种卵巢癌耐药细胞系的建立及其部分耐药相关基因的表达

目的　建立 5种卵巢癌耐药细胞系 ,并比较耐药与其非耐药卵巢癌细胞系之间部分耐药相关基因的表达差异。方法　用卵巢癌细胞系SKOV3、A2 780分别建立顺铂、卡铂、紫杉醇 (商品名 :泰素 )耐药的细胞系SKOV3/DDP、SKOV3/CBP、A2 780 /DDP、A2 780 /CBP、A2 780 /toxol,验证其有关的生物学指标 ;并用RT PCR技术检测耐药与其非耐药卵巢癌细胞系之间部分基因的表达差异。结果　 (1)所有耐药细胞系对相关药物的耐药指数 (RI)较其非耐药细胞系均升高约 3倍或以上 ,并对临床常用的一些化疗药物表现出不同程度的耐受性 ,RI达 2～ 2 0倍 ;耐药细胞的生长速度较其非耐药细胞明显减慢 (P <0 0 1) ;群体倍增时间明显延长 1 4～ 2 4倍 (P <0 0 1) ,但G1、G2 、S期细胞比例无明显改变 (P >0 0 5 ) ;耐药细胞中药物浓度较其非耐药细胞中下降约 2 0～ 8 5倍 (P <0 0 5 )。 (2 )在检测的耐药相关基因中 ,耐药细胞较其非耐药细胞中表达下降的有p5 3、肺耐药蛋白 (LRP 1)、多药耐药相关蛋白 (MRP 1)基因 ,表达升高的有蛋白激酶C(PKC)、拓扑异构酶 (topo)Ⅰ、topoⅡβ基因 ,无明显改变的有谷胱甘肽 S 转移酶 (GST pi)、topoⅡα基因 ,多药耐药蛋白 (MDR 1)基因的表达改变不确定 ,包括升高和下降。结论　在不同类型的耐     

甲氨蝶呤诱导人绒毛膜癌细胞耐药后耐药细胞基因表达谱的变化

目的 探讨人绒毛膜癌获得性甲氨蝶呤(MTX)耐药相关基因。方法 首先采用剂量递增间歇诱导的方法,对人绒毛膜癌细胞株JAR细胞用MTX长期诱导培养,使其获得稳定的MTX耐药表型(命名为JAR/MTX细胞),然后用包含1000个来源于中国汉族人cDNA克隆的基因表达谱芯片,对JAR/MTX细胞与其母系JAR细胞进行基因表达谱的比较。结果历时1年耐药诱导后,JAR/MTX细胞获得对MTX稳定的耐药性,耐药指数7.3。两张基因芯片结果一致的差异表达基因共9条,其中比例大于2的明显上调基因有：红细胞生成素相关细胞特异亚单位1、硫氧还蛋白还原酶1、平滑肌分化特异性蛋白和真核细胞翻译延长因子2;比例小于0.5的明显下调基因有：胰岛素受体、可溶性载体家族1成员3、亚精胺或精胺N1-乙酰氨基转移酶、β-血红素和假设蛋白。结论 JAR/MTX细胞经MTX长期诱导后出现耐药表型,涉及了多个基因表达的改变。     

卵巢癌化疗耐药相关基因与预后的研究进展

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,死亡率居妇科之首.化疗是目前治疗卵巢癌的重要手段之一.化疗耐药是影响晚期卵巢癌患者预后的主要原因.卵巢癌化疗耐药是多基因多因素共同参与的结果.近年来卵巢癌化疗耐药相关基因成为监测预后的指标.主要从细胞内有效药物浓度的降低(MDR基因,MRP,LRP,GST),药物作用的靶点异常(微管蛋白基因),DNA损伤修复功能异常(MMR,BRCA1基因)及细胞凋亡异常(p53、bcl-2基因、caspase,survivin 基因)这四个方面对卵巢癌化疗耐药相关基因及其与预后作一综述.     

转导人肿瘤坏死因子α基因对耐药性绒毛膜癌裸鼠移植瘤耐药性的逆转作用

目的　探讨转导人肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor α,TNF α)基因 ,对耐药性绒毛膜癌 (绒癌 )裸鼠移植瘤耐药性的逆转作用。方法　将绒癌细胞系JEG 3(A细胞系 )、耐药性绒癌细胞系JEG 3/VP2 (B细胞系 )和转导TNF α基因的耐药性绒癌细胞系JEG 3/VP2 /TNF α(C细胞系 )接种于裸鼠颈背部皮下 ,建立绒癌裸鼠移植瘤模型。每种细胞系移植瘤模型均分为对照组 (腹腔注入生理盐水 )和化学药物治疗 (化疗 )组 [腹腔注入鬼臼乙叉甙 (VP 1 6) ] ,观察移植瘤的生长特点、组织学结构以及对化疗药物的敏感性 ;用逆转录聚合酶链反应方法和免疫组织化学方法 ,检测转导TNF α基因的耐药性绒癌裸鼠移植瘤中多药耐药 (multidrugresistance ,MDR1 )基因在mRNA和蛋白水平表达的改变。结果　移植成瘤率均为 1 0 0 % ,潜伏期 1 0～ 1 4d ;移植瘤组织学特征符合绒癌特点 ;C细胞系移植瘤的生长速度最慢 ,明显低于A、B两个细胞系的生长速度 (P均 <0 0 5) ;C细胞系对照组裸鼠的移植瘤[体积 (4 2± 0 5)cm3,重量 (0 95± 0 1 2 )g]比B细胞系对照组 [体积 (7 9± 0 3)cm3,重量 (1 60± 0 0 6)g]明显减少 (P <0 0 5) ,应用同样剂量的化学药物作用后 ,C细胞系化疗组肿瘤的抑制率 (41 0 %～42 5 % )接近A细胞系化疗组 (46     

人卵巢癌细胞阿霉素耐药株的建立及其耐药机制的研究

目的：建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对阿霉素的耐药特征和机制。万法；应用浓度递增和短时间作用法，从人卵巢癌细胞A2780中培养出对阿霉素耐药细胞亚株（A2780／ADM）。采用MTT法检测耐药细胞的耐药指数及对抗癌药物的敏感性，用高效液相色谱仪捡测耐药细胞内阿霉素含量，以及应用RT-PCR法和免疫组化法检测MDR1和GST－π的表达情况。结果：（1）A2780／ADM对ADM的耐药指数为38．2，而且其倍增时间较A2780细胞延长，对VCR、MTX呈高度耐药状态，对KSM、CARP、PYM、VP16、CTX和5－FU均有不同程度的耐药。（2）耐药细胞内阿霉素含量明显低于A2780细胞。（3）耐药细胞MDR1的表达呈阳性，而GST－π只有在高浓度的耐药细胞内才呈弱阳性。结论：A2780细胞对阿霉素的耐药是获得性的，并呈多药耐药特征，其耐药的主要原因是细胞内MDR1的过度表达，导致药物在耐药细胞内浓度降低。此项研究结果有助于卵巢癌患者化疗选用药物时作为参考。     

宫颈鳞状细胞癌ATP-TCA法体外药敏试验与耐药相关蛋白表达的关系

目的:探讨代表不同耐药机制的P糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)、胸苷酸合成酶(TS)在原发宫颈鳞癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系;分析三磷酸腺苷生物荧光法体外药敏试验(ATP-TCA)结果与耐药蛋白表达的关系。方法:收集32例宫颈鳞癌患者的新鲜癌组织制成单细胞悬液,采用ATP-TCA法成功检测上述细胞对11种化疗药物(共16种组合)的体外敏感性;采用EnVision二步法免疫组化检测32例宫颈鳞癌组织中P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白的表达,并分析其与临床分期、肿瘤分化程度的关系。结果:耐药蛋白P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS在宫颈鳞癌组织中的表达与临床分期、肿瘤分化程度无相关性;耐药蛋白P-gp表达与体外PTX+CBP耐药正相关(P=0.040);耐药蛋白TS表达与体外5-FU、5-FU+MMC、5-FU+DDP耐药正相关(P=0.015,0.012,0.006);TopoⅡ,GST-π蛋白表达与宫颈鳞癌体外耐药均无相关性。结论:体外药敏试验联合免疫组化检测,有可能用于宫颈鳞癌化疗前药敏预测。     

活性氧介导P62蛋白激活参与甲氨蝶呤耐药绒癌发病机制研究

目的 探讨甲氨蝶呤（MTX）耐药绒癌的发生机制。方法 2012年5月至2013年1月于北京协和医院以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的MTX耐药绒癌JEG-3/MTXR细胞为研究对象,采用免疫印迹、RT-PCR法检测MTX处理后细胞内P62的变化。流式细胞仪检测MTX诱导后JEG-3/MTXR细胞内活性氧(ROS)变化,采用ROS清除剂MnTmPyP检测MTX作用后JEG-3/MTXR细胞内P62蛋白水平的变化。RNA干扰法沉默P62基因免疫印迹法和流式细胞仪检测MTX诱导后JEG-3/MTXR耐药细胞内PARP蛋白的表达和凋亡率的变化。结果 MTX可诱导耐药绒癌 P62蛋白和mRNA表达水平呈时间依赖性上调。MTX可诱导耐药绒癌ROS表达水平升高,MnTmPyP降低P62蛋白的表达。P62-siRNA可促进JEG-3/MTXR细胞内MTX诱导的凋亡反应蛋白PARP的切割和激活,流式细胞仪检测RNA干扰联合药物组细胞凋亡率（14.4±1.02）%,高于单纯药物应用组（9.1±1.34）%,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 ROS介导P62蛋白激活参与MTX耐药绒癌发生机制,为耐药绒癌临床靶向治疗提供新思路。     

耐药相关基因在卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的 通过测定多药耐药基因（ＭＤＲ１,多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）,肺耐药相关蛋白（ＬＲＰ）和谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－π）的卵巢癌组织中的表达,了解其在卵巢癌化学治疗耐药中的作用。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）测定了４１例卵巢癌,２５例良性卵巢肿瘤和１２例正常卵巢组织中ＭＤＲ１,ＭＲＰ,ＬＲＰ和ＧＳＴ－π的表达,并分析其与临床,病理特征的关系。结果 （１）在正常卵巢,良性卵巢肿瘤     

Development of methotrexate-resistant human choriocarcinoma cells in culture

A human choriocarcinoma cell line, HCCM-5, was fed with medium containing increasing concentrations of methotrexate (MTX). The initial MTX concentration, 10(-9) M which reduced the [3H] thymidine incorporation into DNA, was raised from 2- to 2.5-fold successively. After about 36 weeks of feeding, the cells became resistant to 5 X 10(-7) M which produced complete inhibition of the parent HCCM-5 cell growth. The parent line and its MTX-resistant subline (HCCM-5MTXr) had almost the same population doubling time. There were no apparent differences in morphology and human chorionic gonadotropin secretion between the two cell lines. The development of resistance was accompanied by a 10-fold decrease in the 3H-MTX uptake and a 5-fold elevation of the intracellular dihydrofolate reductase (DHFR) activity. The impairment of MTX transport in HCCM-5MTXr cells continued after transferring the HCCM-5MTXr cells into MTX-free medium, whereas the DHFR activity returned to the level found in the HCCM-5 cells. These results indicate that the MTX resistance acquired in choriocarcinoma cells chiefly involves the impaired transport of MTX and continues after the deprivation of the drug.     

细胞自噬在甲氨蝶呤耐药绒癌中的保护性作用

目的：通过检测耐药绒癌细胞内自噬的变化,以及评估抑制自噬或敲除自噬相关基因后细胞凋亡情况,探讨细胞自噬在耐药绒癌中的作用。方法：以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的甲氨蝶呤（MTX）耐药绒癌JEG-3／MTXR细胞为研究对象。采用透射电镜、免疫荧光法观察MTX处理后细胞内自噬的变化;Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Bec]in-1的表达变化。RNA干扰法沉默自噬相关基因LC3后,采用Westernblot法和Annexin-V／PI双染法流式细胞仪检测MTX作用后JEG-3／MTXR耐药绒癌细胞凋亡的变化。结果：透射电镜和荧光显微镜下均可观察到MTX处理后JFG-3、JEG-3／MTXR细胞内自噬小体的产生;Icm浓度MTX处理后,两种细胞内自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达水平上调。相同浓度MTX处理后,JEG-3细胞内LC3、Beclin-1表达下调。沉默自噬相关基因LC3后,沉默LC3联合MTX组的JEG-3／MTXR和JEG-3细胞内凋亡相关蛋白caspase-9表达上调,凋亡率显著增多。结论：MTX可诱导耐药绒癌产生保护性自噬。