用脂质体法转染COS—7细胞条件的优化

现有的多种真核细胞基因转染方法存在繁琐和效率低的问题，我们利用脂质体包裹的方法，以瞬时表达系统中最常用的ＣＯＳ－７细胞为靶，观察了影响转梁效率的多种因素，优化了转染条件。     

人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基     

rhTPO的克隆及其在原核细胞中的表达

为了更加简便有效地得到重组人血小板生长因子（ｒｈＴＰＯ），以治疗放射及化学药物等所致骨髓损伤造成的血小板减少与缺乏，缓解临床上的出血症状，降低死亡率。方法本实验从６月龄人胚胎肝脏细胞中分离ｍＲＮＡ，设计合成特异性引物，经逆转录，套式ＰＣＲ等步骤克隆出了人ＴＰＯ全基因。将人ＴＰＯ基因亚克隆至原核细胞表达载体ｐＢＶ２２０，形成了重组表达质粒ｐＢＶ２２０／ＴＰＯ，以该重组质粒转化了原核细胞大肠杆菌ＤＨ５α，应用４２℃热诱导表达目的蛋白。结果经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到了ＴＰＯ在原核细胞中的表达，其分子量与目的一致。结论ｈＴＰＯ可以在原核细胞得到良好的表达，为临床血小板减少症的生物治疗奠定了基础。     

KGF基因在COS7细胞中的表达及其活性检测

目的：利用COS7细胞表达角质细胞生长因子(KGF)并检测其活性。方法：利用脂质体把KGF基因转入COS7细胞中，再用Western印迹和ELISA方法检测KGF蛋白的表达，然后用MTT法检测其活性。结果：KGF基因在COS7中得到了表达，并对小鼠肠上皮细胞(IEC-6)具有刺激增殖作用。结论：KGF有望成为肠型放射病治疗的新型药物。     

人血小板生成素在CHO细胞中的稳定表达及其产物鉴定

目前，血小板生成素（ＴＰＯ）的基因工程研究是继促红细胞生成素（ＥＰＯ）之后的又一个热点。由于对ＴＰＯ结构与功能的关系了解不够，其基因工程方面的研究在表达系统的选择和分子结构的设计上均存在很大的盲目性。针对这一问题，作者欲对ＴＰＯ的糖基化程度与其生物学...     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

人白介素6在CHO细胞中的克隆与表达

本研究通过引物设计、转译优化、ＤＮＡ体外重组等技术，构建了ｐＳＶ２·ＩＬ６重组质粒，利用磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷型（ＣＨＯｄｈｆｒ－）株，经选择培养基筛选及逐渐提高甲氨蝶呤（ＭＴＸ）的浓度加压基因共扩增法，获得一株稳定表达人ＩＬ６的细胞株，用ＩＬ６依赖的杂交瘤细胞株７ＴＤ１测定细胞上清液的ＩＬ６生物学活性为１．９×１０５Ｕ／（１０６细胞·ｄ）。     

7TD1细胞及其克隆对IL—6的反应性和依赖性

比较了本院基因医学研究所和北京医科大学提供的两株７ＴＤ１细胞。选择北京医科大学提供的细胞株进行克隆，筛选出对ＩＬ－６增殖反应性和依赖性较强的３株细胞（７ＴＤ１ＭＣ１、７ＴＤ１ＭＣ４、７ＴＤ１ＭＣ５）。其中７ＴＤ１ＭＣ５细胞的反应曲线呈典型的“倒Ｓ”形，对ＩＬ－６的反应性和依赖性很好。ＭＴＴ比色法显示了与Ｔ３Ｈ－ＴｄＲ掺入法一致的结果，采用了７ＴＤ１ＭＣ５细胞及ＭＴＴ比色法测定ＩＬ－６生物活性，可减     

rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

HLA—DR基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

获得表达ＨＬＡ－ＤＲ基因的小鼠墨色素瘤细胞，方法应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞Ｒａｊｉ中克隆了ＨＬＡ－ＤＲ３α和β链ｃＤＮＡ，并经测序证实。将其分别插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ和ｐＣＥＰ４中，用脂质体转上鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，然后用Ｇ４１８和Ｈｙｇ双重筛选。     

重组人促血小板生成素体内生物学活性的研究

目的　探讨重组人血小板生成素 (rhTPO)体内的生物学活性。方法　本研究以Babl/c纯系小鼠为实验对象 ,将其分成实验组及对照组 ,实验前采尾静脉血 ,测小鼠血小板正常值 ;然后连续 7d腹腔注射rhTPO ,并于注射后第 7天及第 14天采眶静脉血 0 .2ml,测定小鼠外周血小板数量 ,同时观察小鼠的死亡情况。结果　在实验第 7天 ,实验组小鼠外周血小板数明显高于同期对照组 (P <0 .0 5 ) ;而且随实验时间的延长 ,实验组血小板数有升高趋势。结论　rhTPO促进小鼠外周血小板的产生 ,增加外周血小板数量。     

Radiation-induced gene expression in MCF-7 cells

PURPOSE: Detection of gene targets applicable to biological dosimetry and early detection of radiation-induced cell damage. MATERIALS AND METHODS: MCF-7 human mammary carcinoma cells were exposed to 2 and 6 Gy X-rays. Expression of 1176 genes was traced with the Atlas Human 1.2 Array (Clontech). RESULTS: (1) Based on data reproducibility (about 98%), a new and improved analysis was employed. (2) Normalization of data using ubiquitin or total gene expression led to the same results. (3) Dose-dependent gene expression was shown for six genes, which were constantly expressed over 1 day (three genes), 2 days (two) and 3 days (one). Differential gene expression was confirmed by RTQ-PCR. Three of the six genes were novel radiation-induced gene targets. (4) When analysing the expression of all genes, the processes of cell degradation (e.g. cell death and protein catabolism) were activated. Simultaneously, inhibition not only of cell proliferation, but also of other cellular functions (e.g. cell repair) was found. Hence, cell death appears a process of 'active silencing'. CONCLUSIONS: With the screening method applied, six radiation-induced gene targets were found, three of which were novel genes. Their applicability in other cell models remains to be tested. Different sets of genes have to be considered for dose assessment, owing to their changes in gene expression with time after irradiation. Furthermore, it has to be investigated whether 'active silencing' represents a general principle of radiation-induced cell death.     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。