胞嘧啶脱氨基酶／5—氟胞嘧啶系统对人胰腺癌细胞恶性增？…

目的 探讨大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶（ＣＤ）／５－氟胞嘧啶（５－ＦＣ）系统对人胰腺癌细胞的体内外生长抑制作用。方法 将含ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体导入人胰腺癌细胞形成转化细胞系、对转化细胞进行体内外药物敏感实验,包括：（１）计算转化细胞在前体药物５－ＦＣ作用下的细胞生长抑制率和克隆形成抑制率;（２）ＭＴＴ法检测旁观者效应;（３）观察５－ＦＣ对转化细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果 转化细胞在５－ＦＣ作用     

CD/5-FC系统抗肿瘤的作用

胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase，CD)／5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)系统是基因介导的酶前药疗法(gene-directed enzyme prodrug therapy，GDEPT)之一，具有选择性和特异性杀伤肿瘤细胞的作用，近年来国内外研究活跃，细胞实验及动物模型研究表明，该系统对全身各系统器官的肿瘤具有不同的作用．     

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶基因治疗系统对K562 B细胞杀伤效应的初步研究

目的:克隆酵母菌胞嘧啶脱氨酶(YCD)基因,观察YCD/ 5氟胞嘧啶(YCD/5-FC)系统对转基因肿瘤细胞的杀伤效应.方法:扩增YCD基因并构建YCD基因重组逆转录病毒载体;载体转染包装细胞获得高滴度病毒并转染高致瘤细胞K562 B,筛选并鉴定阳性转基因克隆;以MTT法检测5-FC对YCD转基因细胞的杀伤效应,测定转基因细胞裂解产物对5-FC→5-FU的转化.结果:PCR法扩增出全长YCD基因,经测序证实序列正确;构建了MSCV-YCD-IRES-EGFP 逆转录病毒载体 ,载体转染包装细胞ФNX-A,获得滴度为3.5×106 CFU/ml的逆转录病毒;病毒转染K562 B,转染率为30％,经筛选获得转基因阳性克隆YCD-K562 B,RT-PCR检测显示YCD-K562 B有YCD 基因的 mRNA表达,其细胞裂解产物可使5-FC转化为5-FU,表明其有CD酶活性;MTT法检测低浓度5-FC(15 μmol/L)作用 96 h对YCD-K562 B有明显的杀伤效应.结论:YCD/5-FC系统对转基因肿瘤细胞有明显的杀伤效应.     

腺病毒介导的CD基因在人胰腺癌细胞中的靶向性表达

【目的】探讨腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (E .coliCD)基因在胰腺癌细胞中靶向性表达的可能性及其作用。【方法】将含癌胚抗原 (carcinoembryonicantigenCEA)启动子的重组腺病毒感染人胰腺癌SW1990细胞 (CEA )、Capan 2细胞 (CEA-)和人宫颈癌Hela细胞 ,观察CD基因在 3种细胞中的表达及细胞对 5 FC的敏感性差异。【结果】腺病毒介导CD基因仅在SW1990细胞中呈专一性表达 ,转导CD基因的SW1990细胞对 5 FC的敏感性明显提高。【结论】含CEA启动子的CD基因疗法可能是胰腺癌靶向性基因治疗的可行途径。     

尿激酶氨基末端基因转移对人肺癌细胞系PG转移性的抑制作用

本研究将氨基末端 (ＡＴＦ)基因导入可自分泌产生尿激酶 (ｕ ＰＡ)和尿激酶抗体 (ｕＰＡＲ)的人高转移性肺癌细胞系ＰＧ ,通过ＡＴＦ基因的表达与ｕ ＰＡ竞争结合ｕＰＡＲ ,观察对肿瘤细胞体外侵袭力以及体内成瘤性和自发性转移的影响。一、材料与方法1 材料 :主要包括真核表达载体ｐｃＤＮＡ3、含尿激酶原全长ｃＤＮＡ的质粒ｐＵＣ9 ｐｒｏＵＫ(由南京大学马忠教授惠赠 )、高转移性人肺癌细胞系ＰＧ(由北京医科大学病理学系建立 )、ＢＡＬＢ/Ｃ裸小鼠、细胞转染试剂、ＲＮＡ提取试剂盒、ｕＰＡ多克隆抗体、孔径为 8.0 μｍ的ＴＥＴＰ膜等。…     

转染人血纤溶酶原Kringle 5基因对人胰腺癌PC3细胞的影响

目的　将人血纤溶酶原Kringle 5基因导入人胰腺癌PC3细胞 ,观察其对人胰腺癌PC3细胞系的基因治疗作用。方法　将外源性Kringle 5通过脂质体转染法导入人胰腺癌PC3细胞 ,筛选阳性克隆 ,同时设空质粒组及PC3细胞为对照。采用RT PCR、免疫组织化学、MTT、电镜、流式细胞术等方法 ,鉴定及检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及Kringle 5蛋白表达情况 ,并用血管内皮细胞增殖实验及裸鼠接种检测目的胰腺癌细胞株表达的Kringle 5蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性及裸鼠移植瘤生长情况。结果　人血纤溶酶原Kringle 5基因及蛋白水平在胰腺癌PC3细胞系均可以稳定表达 ,能抑制ECV30 4血管内皮细胞生长及具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用。结论　成功转染人Kringle 5基因的人胰腺癌PC3细胞可稳定表达Kringle 5蛋白 ,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用 ,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础。     

核糖核酸酶抑制因子与人乳腺癌细胞恶性增殖的相关性研究

目的:探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclesae inhibitor,RI)的表达与人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3恶性增殖之间的关系。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测RI基因表达水平,细胞免疫化学技术检测RI蛋白表达情况。结果:人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖速度、S期所占比例均小于人乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR-3(P<0.05~P<0.01),且MCF-7细胞中RI基因表达水平、蛋白表达水平明显高于MDA-MB-231、SKBR-3细胞(P<0.01)。结论:RI与人乳腺癌细胞恶性增殖生长有一定的相关性。     

胰腺癌组织中乙酰肝素酶蛋白的表达

目的:研究胰腺癌组织中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)蛋白的表达及其临床意义.方法:应用免疫组织化学SP法检测27例胰腺癌组织(Ⅰ期4例,Ⅱ期8例,Ⅲ期11例,Ⅳ期4例;有淋巴结转移者18例,无淋巴结转移9例)、11例癌旁组织中HPA蛋白的表达情况,并对其表达与临床病理特征进行分析.结果:胰腺癌组织中HPA蛋白阳性表达率为70.1%(19/27),高于癌旁组织(9.1%,1/11)(P＜0.05).淋巴结转移组HPA蛋白阳性表达率(83.3%,15/18)高于无淋巴转移组(55.6%,5/9)(P＜0.05).Ⅰ Ⅱ期组HPA蛋白阳性表达率(66.7%,8/12)低于Ⅲ Ⅳ组(80.0%,12/15)(P＜0.05).结论:HPA的异常表达与胰腺癌的发生、发展密切相关,可能是影响胰腺癌预后的重要分子指标.     

恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD/5-FC自杀基因治疗系统的建立

目的 建立针对恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法 以大肠杆菌大量扩增制备含有胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD质粒并经酶切电泳鉴定。DNA序列测定证实pCMVCD质粒是否含有所需要之CD目的基因。用Lipofectamine2000脂质体介导法将pCMVCD质粒转染进入SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞．经G418筛选获得抗性克隆（定名为SHG-44／CD细胞）。结果 pCMVCD质粒经测序证实含有CD目的基因。脂质体介导pCMVCD质粒成功转染了SHG-44细胞。结论 建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

Ad-PUMA联合SU5416对裸鼠胰腺癌生长和转移的抑制作用

目的：研究重组腺病毒（Ad）-PUMA联合SU5416对裸鼠胰腺癌生长和转移的抑制作用。方法：建立裸鼠胰腺癌AsPC-1细胞株原位移植瘤模型,将胰腺癌裸鼠随机分为4组,于模型的第14天,分别自腹腔注射生理盐水100μL（对照组,n=8）、Ad—PUMA3×10^8pfu／100μL（PUMA组,n=10）、SU5416制剂16mg／kg（SU5416组,n=9）和Ad—PUMA＋SU54163×10^8pfu／100μL＋SU541616mg／kg（联合组,n=10）。治疗2周后处死裸鼠,剖腹测量原位肿瘤瘤重、抑瘤率、肿瘤微血管密度、胰腺癌细胞凋亡指数,同时观察腹膜、肝脏及毗邻脏器转移和腹水情况。结果：对照组、PUMA组、SU5416组、联合组诱发肿瘤瘤重分别为（0．72±0．08）、（0．48±0．06）、（0．52±0．07）、（0．21±0．04）g,抑瘤率分别为0、28％、34％、71％,肿瘤微血管密度分别为21．4±2．7、20．2±2．5、8．3±1．6、3．8±1．0,凋亡指数分别为（2．7±1．8）、（13．7±3．4）、（5．5±3．7）、（20．6±8．6）％,腹膜转移率分别为87％、70％、33％、10％,肝转移率分别为75％、50％、22％、0,联合组与对照组比较差异有统计学意义（P均〈0．05）。结论：AdPUMA联合SU5416具有协同抗胰腺癌作用。     

双自杀基因CD+TK对胰腺癌BxPC-3细胞的影响

目的探讨逆转录病毒介导的双自杀基因对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤作用及胰腺癌的基因治疗方法。方法通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体MMLV—CD＋TK导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD＋TK细胞株，收集病毒上清液，浓缩后转染胰腺癌BxPG3细胞系，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的BxPC-3／CD＋TK细胞株。用RT—PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-flourocytosine，5-FC）和（或）无环鸟苷（Ganciciovir，GCV）后，MTT法测定转基因组及未转基因组胰腺癌BxPC-3系细胞的存活率。结果双自杀基因在胰腺癌BxPC-3系细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应效果明显。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死胰腺癌Bx-PC-3系细胞，双自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

人胰腺癌细胞降钙素基因相关肽(CGRP)受体及其对细胞生长影响的研究

本研究首次用放射受体分析法证实人胰腺癌细胞上有特异的降钙素基因相关肽(CG-RP)受体,并用3~H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法测定表明CGRP有促进人胰腺癌细胞生长作用,而CGRP受体拮抗剂可抑制这种促生长作用。此研究结果说明CGRP受体在人胰腺癌细胞生长中起重要作用。     

蛹虫草菌丝体与冬虫夏草抑制人胰腺癌PANC-1

目的 比较人工培养的蛹虫草菌丝体与天然冬虫夏草抑制人胰腺癌PANC-1细胞株增殖的活性,并探讨其作用机制. 方法 MTT法分析蛹虫草菌丝体和天然冬虫夏草对PANC-1细胞的增殖抑制作用,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,Western blot分析细胞凋亡和自噬相关蛋白变化. 结果 蛹虫草菌丝体和天然冬虫夏草都能通过诱导细胞自噬而非凋亡途径,呈浓度依赖地降低胰腺癌PANC-1细胞的存活率.癌基因STAT3的总蛋白和磷酸化水平均明显降低.蛹虫草菌丝体处理后PANC-1细胞促存活蛋白Mcl-1和Survivin的表达水平明显降低,而冬虫夏草并无此作用. 结论 人工培养的蛹虫草菌丝体与天然冬虫夏草相比,具有相似或更强的体外抗胰腺癌细胞增殖活性.     

生长抑素抑制胰腺癌细胞株生长的作用

目的：观察生长抑素对人胰腺癌细胞株HS766T生长的作用；测定神经鞘磷脂（sphingomyolin,SM）、cAMP、细胞内Ca^2 水平，探讨生长抑素的受体后信息传递作用。方法：细胞培养，分别加入不同浓度的生长抑素，PACAP1－38。应用MTT法来观察细胞增殖程度；薄层层析法测定细胞内SM，放免法测定细胞内cAMP含量；Fura-2/AM测定[Ca^2 ]i。结果：不同浓度的生长抑素（10^-6-10^-12mol/L）均能有效地抑制S766T的生长。能抑制HS766T细胞内SM、cAMP生成和细胞内Ca^2 水平，cAMP生成量和细胞内Ca^2 水平与生长抑素浓度呈负相关。结论：生长抑素能抑制HS766T细胞的生长，它的抑制作用是通过受体介导的。     

胰腺癌MTS1／p16基因纯合性缺失和突变的研究

目的：研究人胰腺癌组织及正常胰腺组织中p16基因第1外显子和第2外显子的纯合性缺失和突变情况。探讨p16基因异常与胰腺癌的关系。方法：应用聚合酶链式反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）技术检测51例胰腺癌组织中p16基因第1外显子和第2外显子的纯合性缺失和突变频率,以正常胰腺组织15例为对照。结果：全部被检胰腺癌组织中有23例发生p16基因第2外显子缺失,缺失率45％,有1例发生第1外显子的突变,未发现第1外显子缺失和第2外显子突变。正常胰腺组织中均未发生第1外显子和第2外显子的缺失及突变。结论：p16基因缺失与胰腺癌的发生关系密切,p16基因的突变可能与胰腺癌的发生关系不大。     

全反式维甲酸对胰腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,通过体内实验观察全反式维甲酸(ATRA)对胰腺癌的治疗作用。方法将人胰腺癌细胞株SW 1990和Bx-PC3细胞接种于裸鼠皮下,建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,予ATRA 40 mg/kg每日口服,或4 mmol/LATRA每次0.1 mL隔日瘤内注射。观察瘤体质量和体积变化,TUNEL法观察ATRA干预后移植瘤组织内的细胞凋亡情况,免疫组化法检测caspase-3的表达。结果成功建立两种人胰腺癌细胞株的移植瘤模型;口服和瘤内注射ATRA后,抑瘤率在Bx-PC3移植瘤分别为64.24%和55.78%,在SW 1990移植瘤分别为44.03%和49.13%;TUNEL法和电镜观察证实,ATRA诱导后移植瘤内出现细胞凋亡;免疫组化显示,caspase-3表达增加。结论ATRA口服或瘤内注射均能抑制胰腺癌移植瘤的生长,活化胰腺癌细胞内caspase-3,促进细胞凋亡。     

薏苡仁酯和平阳霉素抑制鼻咽癌细胞增殖的相互作用

目的：探讨薏苡仁酯（coixenolide,CXL)和平阳霉素(pingyangmycin,PYM）抑制人鼻咽癌细胞CNE－2Z增殖的联合效应。方法：采用微量细胞克隆形成法检测CNE－2Z的增殖能力和对药物的敏感性，结果：CZL和PYM均以量效方式抑制CNE－2Z细胞的克隆形成，ID50分别是10^-4.758mol/L和10^-5.494mol/L，将CXL和PYM以4：1的剂量（摩尔浓度）比合用，全部效应协同。两药5：1，抑制率≤50％时，协同；＝60％，相加；≥70％，拮抗。6：1，抑制率＝10％时，协同；≥20％，拮抗。结论：CXL和PYM的相互作用可产生多种联合效应，与合用的剂量，剂量比密切相关。     

腺病毒介导的野生型p53基因表达对入胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨恢复野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建一个Ｅ１区缺失但能表达ｗｔｐ５３基因的５型腺病毒载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，该载体含有人ＣＭＶ启动子、人野生型ｐ５３基因和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号。载体经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染人胰腺癌ＰＣ－２细胞。ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实，转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的表达。结果与对照组相比，转染有Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３的ＰＣ－２细胞生长速度减慢、增殖率降低，软琼脂集落形成能力丧失。结论以腺病毒为载体恢复野生型ｐ５３在胰腺癌细胞的表达，可抑制癌细胞的生长和部分逆转其恶性表型。     

胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用

目的观察胰腺癌疼痛患者的胰腺肿瘤标本内胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达。方法取视觉模拟疼痛评分（VAS）在5分以上的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本,采用RT-PCR及ELISA的方法对胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达进行检测。结果胰腺癌组织中人胰蛋白酶mRNA水平明显高于正常胰腺组织,ELISA显示胰腺癌组织的胰蛋白酶水平明显增高,与正常胰腺组织相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论高水平的胰蛋白酶可能通过激活PAR-2介导胰腺癌疼痛的。