大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定

目的：探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外的共培养方法，并行神经分化诱导。方法：分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，各传至第3代后。取等量细胞混合后共培养，共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导，并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态，经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论：同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞。     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。     

丹参提取物促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的研究

目的研究丹参提取物对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用。方法采用全骨髓细胞接种法和贴壁纯化培养骨髓间充质干细胞,将浓度为0.2、0.4、0.8、1.6 mg/m L和3.2 mg/m L的丹参提取物加入到骨髓间充质干细胞中,观察不同浓度的丹参提取物对骨髓间充质干细胞的增殖作用;采用0.4、0.8 mg/m L和3.2 mg/m L的丹参提取物诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,连续诱导21 d,利用ALP试剂盒测定成骨细胞内ALP活性和茜素红染色观察成骨细胞钙化结节情况;采用Western bloting法测定成骨细胞相关蛋白BMP-2和Runx的含量。结果不同浓度的丹参提取物均能够促进骨髓间充质干细胞的增殖,丹参提取物浓度0.8 mg/m L时对骨髓间充质干细胞的增殖作用最强;ALP测定结果发现0.4、0.8 mg/m L和3.2mg/m L的丹参提取物均能够提高ALP活性,丹参提取物浓度0.8 mg/m L时ALP活性最高;茜素红染色结果发现0.4、0.8 mg/m L和3.2 mg/m L丹参提取物均能够促进成骨细胞的钙化,丹参提取物浓度为0.8 mg/m L时钙化结节数量最多;Western bloting结果表明,0.8 mg/m L的丹参提取物能够促进成骨细胞分化相关蛋白BMP-2和Runx-2表达。结论丹参提取物能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨细胞分化作用。     

大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

目的：以骨髓间充质干细胞作为参考,讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法：通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,离心法获得骨髓间充质干细胞,贴壁培养,通过倒置光学显微镜观察二者形态差异;流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达;MMT法检测细胞生长曲线;特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化,免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果：分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性,且符合间充质干细胞特性,牙髓干细胞第4天进入对数生长期,第7天进入平台期,骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期,第8天进入平台期;经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力,牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力;牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论：牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力,但牙髓干细胞细胞成分相对复杂,增殖能力较强。     

包裹骨形态发生蛋白-2基因转染干细胞的微囊化方法和蛋白释放效应

目的观察转基因骨髓间充质干细胞的微囊化包裹方法和骨形态发生蛋白-2(BMP- 2)释放效应。方法利用高压微电场制备由海藻酸纳和多聚赖胺酸组成的微囊(细胞浓度为3×10~6个/ml,海藻酸钠浓度为1.5%)包被转β-gal(报告基因)或BMP-2基因的骨髓间充质干细胞,根据X-gal染色观察细胞在微囊内的存活情况,ELISA方法检测其所释放的BMP-2蛋白量,共培养方法检测其生物学活性。结果7、14、21、28 d时微囊内转基因细胞X-gal染色均为阳性。包裹后30 d,培养液上清中仍可检测到BMP-2蛋白。转BMP-2基因微囊化细胞与未包裹骨髓间充质干细胞共培养10 d后,ALP活性定量检测结果表明,Adv-hBMP-2转染细胞组ALP活性为(52.537±1.774)U/ml,明显高于未转染细胞组的(42.336±0.857)U/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论微囊化转基因干细胞生长良好,能持续分泌BMP-2蛋白并促进干细胞向成骨细胞方向分化。     

补骨合剂调节大鼠骨髓间充质细胞分化机制的研究

目的：应用体外培养骨髓间充质细胞，在细胞和分子水平观察补骨合剂对细胞分化的影响，探讨补骨合剂治疗骨质疏松症的机制。方法：分离SD大鼠骨髓间充质细胞，通过形态学、碱性磷酸酶、细胞内骨钙素、转化生长因子β1基因表达等指标，对重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)诱导下的骨髓间充质细胞向成骨细胞分化的程度进行探讨。结果：一定浓度的补骨合剂可促进分化中的骨髓间充质细胞分泌碱性磷酸酶和骨钙素，增强rhBMP2的活性，促进分化中的骨髓间充质细胞表达转化生长因子β1，补骨合剂的这种促进骨髓间充质细胞分化作用与密钙息基本相同。结论：补骨合剂不仅可以增强rhBMP2的活性，促进分化中的骨髓间充质细胞表达转化生长因子β1，大量分泌Ⅰ型胶原，以利于钙盐沉积；还可以促进rhBMP2诱导的骨髓间充质细胞分泌碱性磷酸酶和骨钙素，促进骨髓间充质细胞向成骨细胞表型分化．从而促进钙、磷在骨表面沉积。     

α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的 探讨α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞增殖、分化的影响。方法 采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为空白对照组、雌二醇阳性对照组、低浓度α-ZAL组、中浓度α-ZAL组,高浓度α-ZAL组。镜下每天观察细胞形态变化,碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞纯度,MTT实验测定细胞增殖活性绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法(ELISΑ)测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2( Bone morphogenetic protein-2,BMP-2),运用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测护钙素（Osteoprotegerin,OPG）和NF-KB受体活化配体（Receptor actiator of nuclear factor-KB ligand, RANKL）的蛋白水平表达变化。结果 不同浓度的α-玉米赤霉醇可显著的促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,增加细胞活性（P<0.05）,明显提高小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化后ALP和BMP-2的表达（P<0.05）,并且显著的上调了成骨细胞内OPG/ RANKL的表达率（P<0.05）。结论 不同浓度的α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,并且通过上调OPG/ RANKL的表达率抑制成骨细胞细胞向破骨细胞分化,有望成为临床骨折疏松症治疗的激素替代药物。     

七厘散含药血清对骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响

目的 分析七厘散对体外培养的骨髓间充质干细胞增殖，成骨分化的影响。方法 采用5倍等效剂量七厘散灌服大鼠，制得含药血清，以灌服等体积生理盐水制得对照血清；采用贴壁筛选法培养大鼠骨髓间充质干细胞，同时进行细胞表型鉴定，并以含药血清干预第三代rBMSCs。MTT 法检测细胞增殖情况；于干预后的第3、6、9和12d分别测定细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、干预后6、11、16d分别测定骨钙素（BGP）、Ⅰ型胶原、钙盐沉积量及钙化结节数，并比较两组间差异。结果 七厘散含药血清显著促进外源性骨髓间充质干细胞增殖及促进骨髓间充质干细胞成骨性分化，表现在该组的碱性磷酸酶活性、骨钙素、Ⅰ型胶原、钙盐沉积量和钙化结节数高于对照组（P<0.01）。结论 七厘散含药血清具有显著促进rBMSCs增殖和成骨性分化活性的作用。     

前列腺素E1抗大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的最佳浓度探讨

目的探讨在体外条件下前列腺素E1抗大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的最佳浓度。方法提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,取P3-P5代的大鼠骨髓间充质干细胞在体外缺血清缺氧条件下进行培养,将前列腺素E1分别以0μg/L(对照组)、1μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100μg/L的浓度作用于大鼠骨髓间充质干细胞,并设置48 h,72 h二个时间点,用流式细胞检测的方法测定每个时间点及每个浓度组的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率,最后对数据进行统计分析。结果在各个时间点中,质量浓度为1μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100μg/L的前列腺素E1均可减少大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡,其中20μg/L浓度组的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率最低;前列腺素E1在作用48 h后,大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率最低。结论体外缺血清缺氧条件下,前列腺素E1抗大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的最佳浓度是20μg/L,且其抗凋亡作用在48 h时达到高峰。     

骨髓间充质干细胞的贴壁培养及内毒素对其增殖活性的影响

目的贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察不同浓度内毒素对其增殖活性的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法培养大鼠BMSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞CD44、CD29、CD34的表达,流式细胞术检测细胞周期。加不同浓度的内毒素(0、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)作用24h,用四唑盐比色法(MTT)检测BMSCs的增殖。结果分离培养的细胞三代以后呈均一的成纤维细胞样形态,高表达CD44,但不表达CD34、CD45。80%以上的第三代BMSCs处于G1期。不同浓度的LPS作用24h后各组的平均吸光度值(A)比较有统计学意义(F=3.598,P=0.007);0.01μg/mlLPS组A值与其余各组相比,具有统计学意义(P0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可以方便、快捷地获得BMSCs,其在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性;0.01μg/mlLPS可明显促进BMSCs的增殖。     

大鼠睾丸支持细胞对骨髓问充质干细胞免疫抑制作用的影响

目的探索睾丸支持细胞（Sertoli细胞）对骨髓间充质干细胞（BMSC）免疫抑制作用的影响,为二者在移植免疫中的联合应用提供思路。方法二步酶解法处理大鼠睾丸,分离Sertoli细胞;Percoll法分离大鼠BMSC;Ficoll法分离淋巴细胞;刀豆蛋白A（ConA）刺激进行T细胞转化试验;将Sertoli细胞、BMSC和Sertoli细胞＋BMSC分别加入未经ConA处理的静止淋巴细胞培养体系和经ConA处理后的T细胞转化体系,MTT法测定淋巴细胞增殖情况,观察BMSC、Sertoli细胞或二者共培养对T细胞活化、增殖的影响。结果 BMSC、Sertoli细胞以及二者共培养对静止的淋巴细胞无明显作用。BMSC、Sertoli细胞及二者共培养对T细胞的活化、增殖均有明显的抑制作用,且Sertoli细胞与BMSC共培养时抑制作用呈现一定的协同性。结论 BMSC和Sertoli细胞均具有负性免疫调节作用,二者共培养可以进一步增强BMSC的免疫抑制效应。     

表达HTERT的大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性研究

目的将含hTERT基因的重组慢病毒液感染大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定其生物学特性。方法分别将含hTERT基因重组慢病毒液、空病毒液感染大鼠BMSCs,实验分为MSChTERT组、MSC-GFP组和MSC组(未感染组)。体外培养扩增后,通过定量PCR对各组目的基因表达进行检测。观察MSC组及MSC-hTERT组的体外传代次数及细胞形态变化,分析细胞周期。流式细胞仪检测MSC-hTERT组细胞标志物,评估其成骨、成脂分化能力。结果MSC-hTERT组目的基因mRNA表达均高于另两组,体外培养过程中MSChTERT组传代次数和增殖指数高于MSC组,且具备多向分化潜能。结论转染hTERT的BMSCs具备BMSCs同样的生物学特性,且细胞增殖能力加强,可为组织工程研究以及细胞移植治疗提供可靠的种子细胞。     

不同接种浓度的骨髓基质细胞体外生物学活性的研究

目的研究不同初始接种浓度对Beagle犬骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）体外成骨能力的影响。方法将体外培养扩增的第1代BMSCs制成不同浓度（5×10^7cells／mL、5×10^6cells／mL、5×10^5cells／mL）的细胞悬液，分别接种于60mm培养皿，观察矿化结节形成的时间；并分别与胶原膜BME-10X复合，比较2d、5d、7d的碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性。结果细胞初始接种密度越高，形成矿化结节的时间就越短；在细胞载体复合物中，同一浓度组的ALP活性随培养时间的延长而增加；在相同天数，5×10^7cells／mL组与5×10^6cells／mL组、5×10^5cells／mL组之间ALP含量有显著差异，而5×10^6cells／mL组与5×10^5cells／mL组之间则无显著差别。结论BMSCs体外的成骨能力与细胞的接种密度有关，初始接种密度越高，其体外的成骨能力就越强。     

米诺地尔对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及超氧化物歧化酶的影响

目的：探讨米诺地尔对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及超氧化物歧化酶的影响。方法：体外原代培养增生性瘢痕成纤维细胞,将0．25mmol／L～2．0mmol／L的米诺地尔分别作用于增生性瘢痕成纤维细胞24h、48h后,采用MTT、超氧化物歧化酶测定等方法检测细胞的增殖活性及其超氧化物歧化酶的变化。结果：0．25mmol／L～2．0mmol／L的米诺地尔对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖有抑制作用,细胞内超氧化物歧化酶降低。结论：米诺地尔对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖有抑制作用,通过超氧化物歧化酶降低其自由基发挥作用。     

可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞工程化组织的体外实验

目的构建可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞的工程化组织,体外培养并研究其生物学特性,探讨将可注射型生物蛋白胶作为组织工程支架用于临床的实验基础。方法体外培养浇铸有骨髓基质细胞的生物蛋白胶,通过倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜观察载体内细胞生长及载体降解情况,5-溴脱氧尿苷(5-Bromodeocyuridine,BrdU)掺入标记后免疫组化等方法研究可注射型载体内包埋细胞的增殖情况。结果骨髓基质细胞包埋于生物蛋白胶内能很好地存活并增殖,2d后细胞呈典型的成纤维细胞形态;6d后生物蛋白胶边缘部分开始降解,细胞脱落至培养板;体外培养14d,细胞生长良好,大部分生物胶降解,脱落的细胞增多,贴壁生长的细胞形态正常;3周后生物蛋白胶完全降解。结论生物蛋白胶聚合后包埋的种子细胞能够正常增殖,生物蛋白胶是一种理想的适用于微创方法修复组织的可注射型组织工程培养和移植的支架。     

PLGA-[ASP-PEG]三嵌段基质材料对骨髓间充质干细胞黏附增殖及诱导成骨分化的研究

目的：探讨聚乳酸聚乙醇酸共聚物（poly lactic acid-co-glycolic acid,PLGA）-天冬氨酸（asparagic acid,ASP）-聚乙二醇（poly ethylene glycol,PEG）三嵌段多元共聚物上骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的黏附、增殖及成骨分化情况。方法：在PLGA支架材料中引入PEG和含有多个功能位点的ASP,制成PLGA-[ASP-PEG]三嵌段高分子支架材料。将材料与MSCs复合培养,以未改性的PLGA支架材料作对照,通过沉淀法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测MSCs的黏附和增殖变化。用成骨诱导培养基培养14d和28d,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙结节染色了解MSCs成骨分化情况。结果：MSCs在PLGA-[ASP-PEG]材料表面贴壁生长,细胞数目明显多于对照组。细胞黏附率检测显示,PLGA-[ASP-PEG]表面MSCs的黏附性能和增殖能力明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。MTT比色实验显示MSCs在PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料上培养20d后,吸光度（A）值为1.336,约为对照组0.780的2倍。培养12d时,PLGA-[ASP-PEG]材料组的细胞蛋白含量为66.44μg/孔,对照组为41.23μg/孔。成骨诱导培养基培养后,ALP染色和钙结节染色均为阳性,PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料及其降解产物不影响MSCs的成骨分化。结论：PLGA-[ASP-PEG]能促进组织工程种子细胞在骨基质材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,对成骨分化无明显影响。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

补肾通络方对rIL-1β诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及TGF-β_1、CTGF的影响

目的：研究补肾通络方含药血浆对重组大鼠白细胞介素-1β（r IL-1β）干预的大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）增殖与TGF-β1和CTGF表达的影响,以探讨补肾通络方抗肾脏纤维化的分子作用机制。方法：体外培养GMCs,制备补肾通络方含药血浆,用白细胞介素对GMCs进行干预,MTT比色法检测GMCs增殖、ELISA检测TGF-β1蛋白表达,RT-PCR检测CTGF mRNA的表达。结果：与空白对照组比较,白细胞介素能诱导GMCs的增殖、促TGF-β1生成、上调CTGF表达;补肾通络方含药血浆能下调由白细胞介素介导的GMCs增殖、TGF-β1蛋白和CTGF mRNA的表达量,与白细胞介素组比差异有统计学意义（P〈0.01）,且呈时间依赖性。结论：补肾通络方抗肾脏纤维化作用与抑制TGF-β1和CTGF的表达,调节GMCs的功能密切相关。