同时检测脑积水脑组织中多种高能磷酸化合物的反相高效液相色谱法的建立

目的　建立能同时测定狗脑积水不同时期脑组织中肌酸 (Cr)、磷酸肌酸 (Crp)、磷酸腺苷酸 (ATP、ADP、AMP)含量的方法 ,了解脑积水不同时期脑组织的能量代谢受损状况。方法　采用反相高效液相色谱法同时测定狗脑积水脑组织中 Cr、Crp、ATP、ADP、AMP的含量。色谱柱为 Inertsil ODS- 3C18(2 5 0 mm× 4 .6 mm i.d. 5μm )分析柱 ,流动相为 :KH2 PO4 缓冲液 (330 mmol/ L ) -乙腈 - TBA(4 5 mm ol/ L ) (94 :5 .5 :0 .5 ) (p H=6 .2 7) ,检测波长为 2 10 nm。结果　最低检测限为 3.5 5～ 5 .84μmol/ L ,Cr在 5 .6 9～ 36 4 0 .5 0μm ol/ L (r=0 .9993) ,Crp 3.4 7～5 5 5 .5 0μmol/ L (r=0 .9999) ,AMP在 2 .6 9～ 172 3.0 0μmol/ L (r=0 .9993) ,ADP在 2 .6 6～ 170 4 .0 0μm ol/ L (r=0 . 9999) ,ATP在 2 .94～ 1883.5 0μ mol/ L (r=0 .9999)范围内均具有良好的线性关系。回收率为 90 .10 %～10 7.0 0 % ,日内精密度为 1.5 8%～ 3.88% ,日间精密度为 1.99%～ 4 .2 4 %。应用该方法测定了 16只狗脑积水不同时期脑组织中 Cr、Crp、ATP、ADP、AMP的含量 ,获得了良好的结果。结论　该方法准确、灵敏、快速 ,适合于脑积水脑组织中高能磷酸化合物的测定。     

辣根过氧化物酶在Au-Gemini纳米复合物修饰玻碳电极上的直接电化学

将辣根过氧化物酶(HRP)固定在Au-Gemini纳米复合物修饰的玻碳(GC)电极表面,制备了HRP修饰电极(HRP/Au-Gemini/GC),研究了HRP在AuGemini纳米复合膜中的直接电化学,考察了其对H2O2的电催化还原作用。研究表明,HRP在AuGemini 纳米复合膜中发生了准可逆的电化学反应,其氧化峰峰电位(Epa)和还原峰峰电位(Epc)分别为-0.236 V和-0.273 V。HRP/Au-Gemini/GC修饰电极对H2O2具有良好的电催化还原响应,其表观米氏常数Km=2.0×10-5 mol/L,H2O2浓度在1.0～7.0 μmol/L范围内与催化电流呈线性关系。该研究为实现氧化还原酶的直接电子传递和生物传感器的构制提供了一种有效途径。     

蚕砂中叶绿素类金属配合物清除活性氧作用研究

目的　研究蚕砂中提取、精制叶绿素类金属配合物 [Fe2 ( )、Cu2 ( )、Mn2 ( )、Co2 ( ) ]作为抗活性氧 ( O÷2 、H2 O2 、OH· )模拟酶。方法　核黄素—蛋氨酸光照测其清除 O÷2 作用 ,H2 O2 氧化维生素 C法测其催化H2 O2 的分解 ,Fenton-苯甲酸钠荧光法测其对 OH·清除作用 ,小鼠肝匀浆法测其抗脂质过氧化作用。结果　 1×10 - 5～ 1× 10 - 6 m ol/ L具有良好的清除 O÷2 作用 ,活性顺序为 :Cu2 >Mn2 >Co2 >Fe2 ;约 1× 10 - 7mol/ L具有分解 H2 O2 作用 ,活性顺序为 :Cu2 >Mn2 >Fe2 >Co2 ;约 1× 10 - 8mol/ L 具有清除 OH·的功能 ,活性顺序为 :Cu2 >Co2 >Fe2 >Mn2 ;约 1× 10 - 8m ol/ L 可使脂质过氧化产物明显减少 ,活性顺序为 :Cu2 >Co2 >Mn2 >Fe2 。结论　蚕砂中叶绿素类金属配合物可作为抗多种活性氧 ( O÷2 、H2 O2 、OH· )模拟酶     

四苯硼钠和对苯苯酚协同增强化学发光的研究

目的　探讨四苯硼钠 (Sodiumtetraphenylborate ,NaTPB)和对苯苯酚 (Para phenyl phenol ,ppp)的协同增强作用。方法　应用流动注射化学发光分析技术对Luminol H2 O2 HRP增强发光体系中各组分的浓度进行初选及均匀设计优化 ,确定出该发光体系的最佳浓度组合。结果　鲁米诺为 6× 10 -4mol/L ,H2 O2 为 1× 10 -3 mol/L ,NaTPB为 6× 10 -4mol/L ,ppp为 4× 10 -4mol/L时协同增强作用最强 ;该发光体系用于流动注射化学发光测定时 ,检测限可达 8 46× 10 -12 g/mL ,分析灵敏度、重现性比两种增强剂单独使用时都高。结论　在一定条件下 ,增强剂NaTPB和ppp之间有明显的协同增强作用     

蛋白激酶C对肥大细胞活化信号转导的影响

目的 :观察蛋白激酶 C (PKC)对肥大细胞 RBL - 2 H 3活化时酪氨酸磷酸化及 c- fos和 c- jun表达等信号转导的影响。方法 :采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验测定活化的 RBL - 2 H 3细胞在佛波酯 (PMA)作用后 ,酪氨酸磷酸化和组胺浓度的改变 ;用 RT- PCR观察 PKC对 RBL - 2 H3细胞 c- fos和 c- jun基因 m RNA表达的影响。结果 :致敏 RBL - 2 H3细胞 ,在 PMA作用 48h后 ,抗原活化时磷酸化酪氨酸的平均荧光强度和组胺浓度分别为 (2 .79± 0 .0 7) %和 (6 0 .75± 1.38) nm ol/L ,都明显低于对照组的 (4 .47± 0 .0 3) %和 (10 4.47± 1.31) nm ol/L (P<0 .0 5 ) ;c- fos和 c- jun m RNA的表达量分别减少 91%和 82 %。结论 :PKC的活化可调节肥大细胞酪氨酸蛋白激酶活性 ,上调 c- fos和 c- jun m RNA的表达     

黄芪对培养心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用

目的 :探讨中药黄芪 (Astragalus,AS)对培养的心肌细胞氧化性损伤的保护作用及其机制 .方法 :体外培养的新生大鼠心肌细胞 ,分为 3组 :①对照组 (Normal组 ) ;②H2 O2组 :H2 O2 (0 .2mmol/L)与心肌细胞共育 1h ;③黄芪 +H2 O2组 :黄芪处理心肌细胞 30min后 ,加入H2 O2 与心肌细胞共育1h .心肌细胞损伤以细胞线粒体活性和乳酸脱氢酶 (LDH)活性来表示 ,同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛 (MDA)含量 ,均以比色法检测 .结果 :H2 O2 处理细胞后可使细胞LDH活性显著增高 (2 7± 3) μkat/L ,细胞线粒体活性明显下降 0 .36± 0 .0 4 ,SOD活性较正常细胞显著下降(2 31± 2 2 ) μkat/L ,MDA含量显著增高 (1 6± 3) μmol/L .黄芪处理细胞后可显著提高心肌细胞线粒体活性 0 .5 0± 0 .0 5 ,降低LDH活性 (1 6 .4± 1 .8) μkat/L ;并提高细胞抗氧化能力 ,表现为较H2 O2 处理组 ,SOD活性增高 (331± 4 0 ) μkat/L ,MDA含量下降 (1 0 .7± 2 .4 ) μmol/L .结论 :黄芪可对抗H2 O2 对心肌细胞的损伤 ,其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力有关     

白桦脂酸改善氧化应激损伤大鼠血管的内皮依赖性舒张功能

目的:研究白桦脂酸(betulinic acid,BA)舒张血管效应及抗血管氧化应激损伤的血管保护作用,并探讨其内在机制.方法:取胸主动脉进行离体灌流,用累积加药法观察BA对苯肾上腺素(phenylephrine,PE)预收缩的内皮完整血管环和去内皮血管环的舒张作用,并将血管随机分为正常对照组、BA对照组、H2O2组和BA+H2O2组,并在用PE预收缩后,检测血管环对乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)诱导的内皮依赖性舒张反应,血管环张力变化均通过PowerLab生物信号采集系统记录.结果:BA浓度依赖性(10-7 mol/L～10-4 mol/L)舒张PE(10-6 mol/L)预收缩的内皮完整胸主动脉环,pD2值为5.61±0.18,半数有效浓度(EC50)为(2.45×10-6 )mol/L;一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,10-4 mol/L)预处理抑制了该作用,而用吲哚美辛(10-5 mol/L)预处理则无抑制作用.但对PE预收缩的去内皮血管BA无明显舒张作用.H2O2(5×10-4 mol/L)孵育15 min,能降低ACh(10-9 mol/L～10-5 mol/L)诱导的血管舒张作用;EC50的BA孵育30 min,能抑制H2O2氧化应激损伤所致的血管内皮依赖性舒张功能下降.结论:BA具有内皮依赖性舒张血管作用,BA可以减轻H2O2诱导的大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张功能降低,这可能与其降低血管内皮氧化应激,维持血管内皮一氧化氮活性有关.     

普罗布考对过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞凋亡及氧化应激水平的影响

目的:探讨普罗布考对过氧化氢( H2 O2)诱导的心肌细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制.方法:培养的新生大鼠心肌细胞随机分组,分别给予0、1、10和100μmol/L普罗布考预处理6h后,再给予0.2 mmol/L H2O2继续孵育6h.采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测细胞Bcl-2及Bax mRNA的...     

2型糖尿病患者血浆前胰岛素水平

目的 :通过检测前胰岛素水平来探讨 2型糖尿病患者高胰岛素血症的原因。方法 :采用放射免疫分析法测定 2型糖尿病患者和正常对照组血浆前胰岛素 (PIM)、胰岛素 (IRI)和 C肽 (CP)水平。结果 :2型 DM组空腹 PIM(2 7.89± 2 2 .37pmol/ L)、IRI(186 .6 3± 136 .97pmol/ L)水平和 PM/ IRI比值 (17.11± 9.35 % )均明显高于对照组 PIM (6 .75± 5 .6 2 pmol/ L ) .IRI(10 7.6 7± 2 6 .43pm ol/ L )水平和 PIM/ IRI比值 (5 .6 7±3.6 6 % ) (P均 <0 .0 1) ;两组之间空腹 C P水平差异无显著性意义 (6 83.1± 5 87.4pm ol/ L比 5 2 8.0±2 0 1.3pm ol/ L,P>0 .0 5 )。结论 :2型糖尿病患者的高胰素血症主要是高前胰岛素血症所致 ,可能是胰岛素抵抗的原因之一。     

正常人外周血单核细胞内谷胱甘肽含量的测定

目的 :建立外周血单核细胞内谷胱甘肽 (GSH)含量的检测方法及健康人的参考值。方法 :利用 Tietze还原酶法检测不同性别、不同年龄健康人群外周血单核细胞内的 GSH含量。结果 :正常人群中外周血单核细胞内 GSH含量男女分别为 :[(1 33.88± 72 .32 )× 1 0 - 9]mm ol/ L,[(1 4 1 .5 1± 5 8.98)× 1 0 - 9]mm ol/ L,男女之间无明显差异 (P >0 .0 5 ) ,测得各年龄段值 :30岁以下为 [(1 32 .99± 4 9.1 6 )× 1 0 - 9]m mol/ L ,30～ 39岁为 [(1 2 9.0 0± 6 8.4 1 )× 1 0 - 9]m mol/ L ,4 0～ 4 9岁为 [(1 32 .6 7±4 7.2 5 )× 1 0 - 9]mm ol/ L ,5 0～ 5 9岁为 [(1 5 2 .1 7± 73.72 )× 1 0 - 9]mmol/ L ,6 0岁以上为 [(1 5 0 .84± 1 0 4 .2 7)× 1 0 - 9]m mol/ L。各年龄段 GSH值无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 :该方法所测结果可信 ,可作为使用内源性 GSH合成抑制剂增强放疗和化疗效果的参考依据。     

用化学发光法测定辣根过氧化物酶几种体系的研究

Four systems were studied used for chemiluminescent determination of HRP and the determination conditions optimized. In luminol-H2O2 (NaOH) system, HRP was determined conveniently in the range of 0.05-4 pmol, with a correlation coefficient of 0.998 for the linear log-log equation and a limit of detection of 16 fmol HRP. In pyrogallol-H2O2 (pH 6.5) system, 0.1-100 pmol of HRP were determined, based on three log-log regression equations with correlation coefficients of 0.997, 0.994 and 0.999, respectively, and limits of detection of 3-17 fmol HRP. Luminol-H2O2-para iodophenol system was used to determine HRP in the range to 10-50 fmol, based on the chemiluminescence intensity at 1 min and the correlation coefficient of the log-log equation being 0.996 with a limit of detection of 10 fmol HRP. When p-hydroxybiphenyl was used to take the place of p-iodophenol and the chemiluminescence intensity at 1 min or 3 min measured, 6-40 fmol HRP were determined with a correlation coefficient of 0.994 or 0.995 for the log-log equation and a limit of detection of 6.5 or 3.3 fmol HRP.     

动物原代细胞彗星试验敏感性筛选

目的：筛选一种动物原代敏感细胞用于彗星试验，使该试验能更广泛地对环境样品的遗传毒性进行监测。方法：用重铬酸钾(K2CrO7)和过氧化氢(H2O2)作为受试物对小鼠的肝、脾、肾细胞进行彗星试验，观察K2CrO7和H2O2对这3种细胞造成的DNA损伤来判断细胞的敏感性。结果：以K2CrO7染毒的彗星试验中肝细胞的检测阈值(10nmol／L)低于为脾和肾(100nmol／L)，以H2O2染毒的彗星试验中，在相同浓度下肝细胞迁移长度最长。结论：肝细胞具有敏感性高、自身活化能力强、取材方便、耗时短等优点，可以作为一种检测细胞应用于彗星试验对环境样品进行遗传毒性监测。     

用化学发光法测定辣根过氧化物酶几种体系的研究

作者采用四种体系,确定了用化学发光法测定辣根过氧化物酶(HRP)的最佳测定条件和操作步骤。用鲁米诺-H_2O_2(NaOH)可以方便地测定0.05～4pmol HRP,绝对检测限16fmol。用邻苯二酚-H_2O_2(pH6.5)体系可测定0.1～100pmol HRP,绝对检测限3～17fmol。用鲁米诺-H_2O_2-对碘苯酚(pH8.5)体系,可由1分钟时的光强度测定10～50fmol HRP,绝对检测限10fmol。用对羟基联苯代替对碘苯酚,测1或3分钟时的光强度可测定6～40fmol HRP,绝对检测限6.5或3.3fmol.     

过氧化物诱导LO2细胞凋亡时Fas mRNA表达及Ca^2＋流变化的单 …

探讨过氧化物所致肝细胞凋亡时Ｆａｓ基因表达与Ｃａ＾２＋流变化的相互关系。方法应用全细胞膜片错单细胞逆转录聚合酶链反应技术进行Ｈ２Ｏ２诱导人类正常肝细胞ＬＯ２细胞ＦａｓｍＲＮＡ表达的单细胞分析,应用全细胞膜片错显微荧光单细胞胞浆游离钙浓度测量技术、流式细胞术、扫描电镜观察同期瞬时Ｃａ＾２＋流变化及早期凋亡（Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ）细胞指数和细胞膜变化。结果Ｈ２Ｏ２作用２ｈ单个ＬＯ２细胞电泳图分析可见Ｆａ     

壳聚糖对地钱细胞生长和酚类次生代谢的影响

目的：探讨壳聚糖诱导子对地钱细胞生长和酚类次生代谢的影响。方法:对壳聚糖-地钱细胞诱导体系的细胞生物量、叶绿素、活性氧（H₂O₂和O^-₂）、细胞膜通透性和膜脂过氧化产物（MDA）以及酚类次生代谢物苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚等生化指标进行测定。结果:细胞生长下降(P<0.05),叶绿素含量明显低于对照组(P<0.01),胞外pH趋向碱性化(P<0.01),活性氧含量急剧增加和膜脂过氧化增强(P<0.01),次生代谢PAL活性和多酚含量均显著增加(P<0.01)。结论:壳聚糖通过降低地钱细胞还原能力而增强其氧化能力,从而有利于酚类次生代谢的生物合成。     

Preparation of Monoclonal Antibody and Development of Enzyme-linked Immunosorbent Assay Specific for Escherichia coil O157 in Foods

OBJECTIVE: To prepare monoclonal antibodies (MAb) and antisera specific for Escherichia coli (E. coli) O157, and to develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect E. coli O157 in foods. METHODS: Spleen cells from BALB/c mice immunized with the somatic antigen of E. coli O157:H7 were fused with murine Sp2/0 myeloma cells. The hybridoma cell line specific for E. coli O157 was established after having been subcloned. Antisera specific for E. coli O157 was prepared by intravenous injection into New Zealand rabbits with a stain of E. coli O157:H7. The sandwich ELISA was developed with the polyclonal antibody as the capture antibody and the MAb 3A5 as the detection antibody. The inoculated ground poultry meat and pasteurized milk were tested to confirm efficiency of the method. RESULTS: MAb 3A5 specific for E. coli O157 and O113:H21 belonged to subtype IgM. The ascetic titers of the antibody was 1:1x10(6). No cross-reactivity of the MAb was observed with strains of Salmonella spp, Yersinia enterocolitica, Shigella dysenteriae, etc. The purified polyclonal antibody had a titer of 1:1x10(5) with E. coli O157. The detection limit of this sandwich ELISA was 10(3)-10(4) cfu E. coli O157/mL in pure culture with a high specificity, which was characterized by every non-O157 strain with negative response. With 10h enrichment procedure, E. coli O157:H7 recovered well from inoculated ground poultry meat and pasteurized milk at levels of 0.1 cfu/g and 0.1 cfu/mL. CONCLUSION: MAb 3A5 specific for E. coli O157 and O113:H21 can be produced by immunizing BALB/c mice with a strain of E. coli O157:H7. Then a sandwich ELISA can be developed with the polyclonal antibody as the capture antibody and the MAb 3A5 as the detection antibody. The method is proved to be a sensitive and specific technique to detect low number of E. coli O157 in food.     

New fluorimetric assay of horseradish peroxidase using sesamol as substrate and its application to EIA

Horseradish peroxidase (HRP) is generally used as a label enzyme in enzyme immunoassay (EIA). The procedure used for HRP detection in EIA is critical for sensitivity and precision. This paper describes a novel fluorimetric assay for horseradish peroxidase (HRP) using sesamol as substrate. The principle of the assay is as follow: sesamol (3,4-methylenedioxy phenol) is reacted enzymatically in the presence of hydrogen peroxide to produce dimeric sesamol. The dimer is fluorescent and can be detected sensitively at ex. 347 nm, em. 427 nm.The measurable range of HRP was 1.0×10^?18 to 1.0×10^?15 mol/assay, with a detection limit of 1.0×10^?18 mol/assay. The coefficient of variation (CV, n=8) was examined at each point on the standard curve, with a mean CV percentage of 3.8%. This assay system was applied to thyroid stimulating hormone (TSH) EIA using HRP as the label enzyme.     

HRP逆行示踪对人工组织神经移植物辅加NRF修复大鼠坐骨神经缺损的评价

目的：用HRP逆行示踪法评价人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠周围神经缺损的效果。方法：壳聚糖套管和聚乙醇酸纤维组成人工组织神经移植物并辅加神经再生素，修复大鼠的坐骨神经缺损（10mm)。术后24周时，进行大鼠HRP逆行示踪试验。结果：脊髓及背根神经节中均出现数量不等的被HRP标记的神经元胞体。结论：人工组织神经移植物辅加神经再生素对缺损的神经修复具有良好的桥梁作用和促神经生长作用。     

大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测

目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐（polyP）的可靠方法。方法提取并纯化大 肠杆菌O157:H7 野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察 细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80 ℃速冻溶解、-20 ℃速冻溶 解、60 ℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定 荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1 两个突变株polyP 含量。结果应用 360 nm 激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm 激发波长,DAPI-polyP 最大发射波长为550 nm;应用 405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光（425~475 nm）,应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光（500~560 nm）;最佳 细菌前处理方法为-80 ℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5（R2=0.991）,测定各株菌polyP量,其中野生株显 著高于ppk1缺失突变株。结论DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在 肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持。     

壳聚糖/碳纳米管修饰电极电化学免疫传感器用于甲胎蛋白检测

目的构建壳聚糖/碳纳米管(CNT)修饰电极电化学免疫传感器用于甲胎蛋白(AFP)检测的新技术。方法采用壳聚糖/CNT复合物修饰玻碳电极,通过共价键合方式将AFP抗体固定在修饰电极表面,固定抗体的电极与AFP、辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP抗体反应,构筑夹心型免疫复合结构。HRP催化TMB底物产生电流信号,电流信号大小与AFP浓度成正相关,实现对AFP的高灵敏检测。结果该电化学免疫传感器可以准确检测AFP标准样品,也可用于检测血清中AFP的浓度。结论壳聚糖/CNT修饰电极构建的用于AFP检测的电化学免疫传感器具有较高的灵敏度和准确性。