甜橙中UDP-鼠李糖合成酶基因CsRHM的克隆与鉴定北大核心CSCD

UDP-鼠李糖是一种由鼠李糖合成酶(rhamnose synthase,RHM)催化合成的糖苷供体,是合成各种鼠李糖糖苷类次生代谢产物的重要组成之一。该研究从甜橙中首次克隆得到一个RHM基因(CsRHM),并进行生物学信息分析,体外功能鉴定等特异性分析。结果显示CsRHM的开放阅读框为2007 bp,编码668个氨基酸,推测相对分子质量为75.27 kDa,理论等电点为6.97,具有RHM酶家族的特征信号序列(GxxGxxG/A和YxxxK)。多序列对比与系统进化树显示,CsRHM与其他物种的RHM具有同源性。体外酶促反应结果证实CsRHM重组蛋白具有将UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖的催化活性,并且明确了其催化的酶动力学参数V_(max)=0.3737μmol·L^(-1)·min^(-1),K_(m)=21.29μmol·L^(-1),K_(cat)=0.24 s^(-1),K_(cat)/K_(m)=1.13×10^(4)s^(-1)·L·mol^(-1)。该研究首次报道了CsRHM,并验证了其体外催化功能,为进一步研究生物合成UDP-鼠李糖奠定基础。     

红花黄酮醇合成酶基因片段的克隆及表达分析

目的克隆红花花瓣中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并研究其在不同开花时期的表达量。方法根据红花花瓣转录组测序结果挑选FLS基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增FLS基因片段并连接到PEASY-T1载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果获得了224 bp的序列,将获得的序列在NCBI上进行Blast比对,该基因与其他物种的FLS基因具有较高的同源性。结论克隆了红花FLS基因中间片段,根据FLS基因片段设计引物,对红花不同品种不同开花时期进行荧光定量PCR分析,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。     

何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆何首乌苯甲酮合成酶基因并作序列分析.方法 以何首乌Polygonum multiflorum Thunb.为材料,根据其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetone synthase,BAS)基因cDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和3`-RACE,克隆其基因.结果 从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1 049 bp的基因片段.序列分析表明该片段具有典型的CHS基因家族的结构域,为何首乌的BAS基因片段,命名为PmBAS.将得到的序列提交GenBank,序列号为FJ601686.对获得的PmBAS的氨基酸序列进行比较分析,发现PmBAS不含有Phe215,这种差异可能是CHS与BAS催化不同反应的重要原因之一.何首乌BAS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近.结论 对利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义.     

铁皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆铁皮石斛Dendrobium officinale蔗糖合成酶基因并对其表达分析,为研究铁皮石斛多糖合成与蔗糖合成酶活性关系及调控表达提供理论依据.方法:基于GenBank上已知的蔗搪合成酶基因SS同源序列,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛蔗糖合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析.结果:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,该基因cDNA全长2 424 bp,编码807个氨基酸(命名为DOSS1),登录号HQ856835,该基因氨基酸序列与兰科植物Moluara yellow(AF530568)同源性达到95%,与Oncidium goldiana(AF530567)同源性达到90%,与禾本科植物的SS基因同源性在80%以上.并对其进行大肠杆菌原核表达诱导,诱导的工程菌能明显表达出一条相对分子质量约为92×10(3)左右的蛋白质,与理论相对分子质量基本相符.结论:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,并诱导出一条与理论蛋白相对分子质量相符的蛋白条带.     

红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

目的克隆红花查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),运用生物信息学分析CHS,比较花期中每天CHS的表达,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法从新鲜红花花冠中提取RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,克隆获得CHS。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA5.1构建CHS与相关物种CHS的系统进化树,利用real-time PCR分析花期中每天红花CHS的表达量,并进行分析和比较。结果克隆获得的红花CHS,序列全长为1 149 bp,具有1 041 bp的完整开放阅读框,编码346个氨基酸。将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现,该蛋白属于CHS家族,比对结果显示红花CHS与100余种NCBI上登录的植物有相似性,其中与水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜的相似性分别达95%、95%、94%、94%。将相似性在90%以上的物种用MEGA5.1构建进化树,结果显示红花CHS与水飞蓟CHS亲缘关系最近。通过ProtParam预测红花CHS蛋白分子式为C1678H2693N451O493S20,相对分子质量为37 700,等电点为6.10,负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为42,正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为38。基因表达分析结果表明红花CHS在花期第3天的相对表达量最高,远远高于花期其余时间。结论成功克隆、分析并表达了红花CHS,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶(CHS)基因进行克隆及序列分析.方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD 18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9％以上.结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的克隆与表达分析

目的从罗马洋甘菊Chamaemelum nobile中克隆萜类化合物合成关键酶吉马烯A合成酶(germacrene A synthase,GAS)cDNA全长,并对其进行生物信息学和组织表达分析。方法基于前期对罗马洋甘菊转录组测序结果,设计特异性引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到GAS的cDNA全长,利用生物信息学手段对其核苷酸和编码的氨基酸序列进行分析,并预测其编码的蛋白质的理化性质和功能。通过实时定量PCR技术(qRT-PCR)检测罗马洋甘菊GAS基因(CnGAS)在罗马洋甘菊不同组织的表达水平。结果扩增得到的罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的cDNA全长为1 785 bp,命名为CnGAS(GenBank登录号为KU589283),包含1个1 683 bp的开放阅读框(ORF),编码561个氨基酸,预测的相对分子质量和等电点分别为6 470和5.21。CnGAS基因编码的氨基酸序列与其他植物的GAS蛋白高度同源,且含有DDxx D保守序列。系统进化树表明CnGAS基因与菊科植物的GAS基因的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示CnGAS基因在罗马洋甘菊各组织中均有表达,且花中表达量最高。结论从罗马洋甘菊中克隆得到CnGAS基因,分析了该基因在不同组织中的表达水平,为罗马洋甘菊萜类化合物的生物合成代谢途径的研究奠定了基础。     

大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因的克隆及其序列分析

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计特异引物,以嫩叶总RNA逆转录的c DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Am Csl基因全长,并进行TA克隆测序,利用多种软件对该序列进行生物信息学分析。结果:Am Csl全长c DNA为1 438 bp,包含1个561 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码186个氨基酸,蛋白质分子式为C_(1011)H_(1547)N_(233)O_(257)S_(10),理论相对分子质量为22. 40 k Da,理论等电点(PI)为7. 59,脂肪族指数(AI)为116. 88,存在跨膜区,无信号肽,可能定位于内质网膜,平均疏水系数为0. 670,不稳定指数为42. 56,属于疏水性不稳定蛋白,保守结构域包含了1个纤维素合成酶超家族结构域,二级结构以α-螺旋为主。氨基酸多序列比对和系统进化树分析发现,Am Csl与同科植物葡萄有较高的同源性。结论:获得了大叶蛇葡萄Am Csl基因的全长,对其进行了初步的生物信息学分析,为进一步研究大叶蛇葡萄多糖的积累和生物合成的调控奠定了必要基础。     

广佛手黄龙病的鉴定

目的:该文从多方面进行分析、比较,及时、准确地鉴别广佛手黄龙病,以便于及时确定病害、防控病情。方法:通过性状分析,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),酶切反应及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测多种手段相结合,对广佛手黄龙病进行鉴定。结果:从性状上来看,感病广佛手有典型的叶片斑驳型黄化、果相对较小,甚至畸形的特征,但并没有发现"红鼻子果"现象,这些均可以作为田间初步判别广佛手黄龙病的依据; RT-PCR检测及酶切反应结果表明,引物为OI1/OI2c时,广佛手病株有特异性条带1 160 bp,且能被Xba I酶切成520 bp和640 bp,这与其他被黄龙病侵染的柑橘属植物的检测结果一致; Real-time PCR检测结果显示,被黄龙病侵染的广佛手叶片有扩增曲线和熔解曲线,熔链温度为82℃,且Ct值在24. 6～28. 2,而广佛手正常株没有扩增现象出现。结论:性状分析可以在田间初步判别黄龙病,但是具有一定的主观性,RTPCR及Real-time PCR检测能进一步确定广佛手黄龙病,且q PCR检测更加灵敏,还可以定量。通过性状分析以及分子鉴定的结合,能够更加及时、准确地确定广佛手黄龙病。     

洋常春藤鲨烯合成酶基因HhSS的克隆与表达分析

目的克隆获得洋常春藤Hedera helix鲨烯合成酶基因(HhSS)cDNA全长序列并进行生物信息学分析及表达分析。方法根据洋常春藤转录组数据信息设计引物,通过RACE克隆方法获得HhSS基因序列;采用DNAMAN、PROTPARAM、TMHMM、PSORT、Scan Prosite、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学工具分析序列信息及编码蛋白的理化特性、结构域等特征;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行HhSS基因的检测分析。结果 RACE克隆获得HhSS(Gen Bank登录号KX056078)基因cDNA序列全长1 889 bp,包含一个从248~1 477 bp的完整开放阅读框(ORF)以及247 bp的5’非编码区(5’UTR)和412 bp的3’非编码区(3’UTR)。该基因编码409个氨基酸,相对分子质量为46 800,等电点为5.68。HhSS蛋白具有植物SS蛋白的特征结构域和跨膜区,与刺五加、人参等同科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明洋常春藤叶片中HhSS基因的相对表达量与常春藤皂苷含量存在正相关性。结论洋常春藤HhSS基因的成功克隆及表达分析研究,为阐明HhSS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用及代谢调控研究提供理论依据和技术基础。     

丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与分析

目的:获得丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(GGPS),并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:根据GGPS蛋白序列保守区域设计简并引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从丹参根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Target P 1.1分析信号肽序列,MEGA4.0比对已有GGPS蛋白序列,并构建进化树;用半定量RT-PCR检测其在丹参子叶期根、叶和花期根、茎、叶、花蕾、花中的表达情况;设计特异引物,从丹参基因组DNA中扩增,获得编码完整的GGPS基因,初步分析该基因结构.结果:得到1条长1298 bp的GGPS cDNA序列,其ORF框长1 095 bp,编码1段含有52个氨基酸质体定位信号肽的364个氨基酸序列,具有多聚异戊二烯基合成酶的特异序列,与已报道的GGPS基因有60%以上的同源性;RT-PCR半定量分析表明该基因在所分析的各组织中均有表达,尤以花期叶片中的表达最强;基因结构分析表明该基因有1个397 bp的内含子.结论:首次得到丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因,为其功能研究提供了基础.     

滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的 获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因(PpCAS)的全长cDNA序列,并进行序列分析.方法 利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3'及5'末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析.结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框(ORF)为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×104,等电点(pI)为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60％～83％ PpCAS蛋白.结论 从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征.     

红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析

目的克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。方法根据绞股蓝与罗汉果SS基因c DNA比对分析的结果,设计SS的5’端简并引物,采用3’RACE扩增红花栝楼SS全长c DNA基因。结果获得红花栝楼SS c DNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基。通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78%~94%,核苷酸的同源性为74%~93%。结论成功克隆了红花栝楼SS的全长c DNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

卷叶贝母环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

目的对卷叶贝母Fritillaria cirrhosa中参与生物碱合成的关键酶环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因进行克隆,并对其进行生物信息学和表达分析。方法基于转录组测序结果,通过PCR技术克隆卷叶贝母CAS基因(FcCAS)开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,并基于在线工具对cDNA序列进行生物信息学分析。通过荧光定量(q RT-PCR)手段检测FcCAS在野生鳞茎与愈伤组织(通过激素组合刺激获得的组织培养物)中的表达情况并测定总生物碱的含量。结果 FcCAS编码区ORF长为2 271 bp,编码756个氨基酸,并与NCBI上公布的天门冬、芭蕉、油棕等植物CAS蛋白的相似性达80%以上;qRT-PCR与总生物碱含量测定实验表明FcCAS的表达水平与总生物碱含量的变化趋势一致,都是愈伤组织高于野生鳞茎。结论 FcCAS在不同组织状态下表达量差异较大,FcCAS是一个有生物学功能的蛋白质,受激素组合诱导表达,为进一步研究CAS对卷叶贝母生物碱含量的影响和表达调控奠定基础。     

不同来源和品种化橘红果实中肌醇含量比较

目的:考察不同来源和品种化橘红中肌醇的含量,为化橘红质量标准和开发利用提供科学依据。方法:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法进行测定,色谱柱Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+(8%)(Phenomenex,7.8mm×300 mm);流动相为去离子水,流速0.40 mL.min-1,飘移管温度80℃,喷雾管加热状态100%加热状态,雾化气体为空气,压力40 bar;柱温35℃。结果:肌醇在0.25～8.00 g.L-1线性关系良好(r=0.999 9),平均回收率为98.94%,RSD2.19%,样品中其他成分不干扰测定。结论:化橘红不同栽培品种中肌醇含量差别较大,以陆福品种含量最高,在发育过程中可能呈上升趋势,广西市售化橘红与化州基地采收品含量无明显差别。     

大花胡麻草环烯醚萜合酶基因的克隆与表达分析

目的克隆大花胡麻草环烯醚萜合酶基因(CgIS),并进行表达分析。方法以大花胡麻草根、茎、叶转录组中唯一的CgIS基因序列为基础,采用RT-PCR技术从大花胡麻草幼叶克隆CgIS基因,并进行组织特异性表达分析。结果大花胡麻草CgIS基因(GenBank登录号MH794270)全长1 185 bp,编码394个氨基酸;CgIS蛋白相对相对分子质量44 670,理论pI为6.17;该蛋白属于孕酮5β-还原酶(P5β-R)家族成员,可能定位于细胞质;该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋(40.61%)和无规则卷曲(46.70%)构成;该蛋白具有SDR(短链脱氢酶/还原酶)和P5βR蛋白保守结构域;CgIS蛋白与芝麻SiIS蛋白亲缘关系最近;CgIS基因主要在叶中表达。结论克隆了CgIS基因,并对其进行表达分析,为进一步研究该基因的功能和环烯醚萜类的生物合成途径奠定基础。