三氧化二砷对A375人恶性黑素瘤细胞株酪氨酸酶活性及黑素生成的影响

目的 探讨三氧化二砷(As₂O₃)对A375人恶性黑素瘤细胞株酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。方法 利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定细胞活力,采用酶学方法测定酪氨酸酶活性,465nm比色法测定黑素含量。结果 As₂O₃浓度<0.01μmol/L时,随As₂O₃浓度的增加,促进黑素瘤细胞的增殖、黑素的合成及上调酪氨酸酶的活性;As₂O₃浓度等于0.01μmol/L时作用最强。0.1～1μmol/L则表现为抑制作用;>1μmol/L则出现细胞毒性作用。结论 经As₂O₃处理后A375人恶性黑素瘤细胞株的细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素的生成与As₂O₃浓度呈双相性变化。     

白念珠菌对角质形成细胞β防御素-2 mRNA表达的影响

目的 探讨白念珠菌及其菌体成分对人角质形成细胞β防御素-2表达的影响。方法 采用酶解、反复冻融、超声破碎和超速离心等方法制备真菌成分;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测白念珠菌及其菌体成分刺激人角质形成细胞24h后β防御素-2mRNA表达。结果 正常培养的人角质形成细胞和角质形成细胞永生细胞系HaCaT均有β防御素-2mRNA的少量表达,白念珠菌、白念珠菌细胞壁提取物和纯甘露聚糖可以使β防御素-2mRNA表达增强(P值分别<0.01、0.05和0.01),而白念珠菌培养上清液和细胞浆提取物对β防御素-2表达无明显影响(P>0.05)。结论 白念珠菌可上调角质形成细胞β防御素-2mRNA的表达,甘露聚糖可能是起诱导作用的活性成分。角质形成细胞通过表达β防御素-2在皮肤黏膜的抗感染防御机制中发挥重要作用。     

人参皂苷CK对H2O2诱导人黑素细胞凋亡的保护作用

目的探讨人参皂苷化合物K(CK)对H₂O₂诱导来自新生儿中度色素沉着性包皮的正常人表皮黑素细胞(HEMn-MP)细胞凋亡的保护作用及可能机制。方法采用磷酸激酶抗体阵列检测HEMn-MP细胞各阵列蛋白磷酸化水平;比色法测定各组HEMn-MP细胞半胱天冬酶(Caspase-3)活性。结果CK减弱H₂O₂诱导的HEMn-MP细胞P53蛋白磷酸化;CK降低H₂O₂诱导的Caspase-3活化。结论人参皂苷CK可能通过抑制细胞凋亡对H₂O₂诱导的黑素细胞损伤有保护作用,因而可作为治疗白癜风的潜在药物。     

中波紫外线辐射对人表皮角质形成细胞核因子κB转录活性的影响

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射对表皮角质形成细胞核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法 正常人表皮角质形成细胞取自健康儿童包皮,并培养于37℃、5%CO₂的培养箱中;以20、60和120 mJ/cm² UVB辐射培养细胞;分别提取UVB辐射0、2、24和48 h后角质形成细胞的全细胞蛋白、核蛋白和胞浆蛋白;免疫印迹方法检测分析全细胞蛋白和核蛋白的NF-κB/p65以及胞浆蛋白NF-κB抑制物(IκB-a)的动态变化;电泳迁移率变更分析(EMSA)方法检测分析NF-κB的转录活性。结果 UVB辐射可显著促进角质形成细胞总蛋白和核蛋白中NF-κB的蛋白表达(P<0.05),且表达量与辐射剂量成正比,UVB辐射后2 h即可有NF-κB的蛋白表达水平的升高。24 h后达高峰并持续高水平表达至48 h:不同剂量UVB辐射角质形成细胞后的不同时间,均可促进NF-κB转录活性:UVB辐射可显著抑制角质形成细胞胞浆IκB-a蛋白的表达(P<0.05)。结论 UVB辐射可显著促进角质形成细胞NF-κB的转录活性。     

扇贝多肽保护中波紫外线损伤HeLa上皮细胞的研究

目的 探讨扇贝多肽对中波紫外线(UVB)照射下HeLa上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法 建立UVB(辐照强度为7.15×10^-5J/cm²)对HeLa上皮细胞氧化损伤模型。HeLa上皮细胞随机分为6组,未辐射对照组、辐射损伤组[损伤对照组、0.5%扇贝多肽(PCF)组、1%PCF组、2%PCF组、1%维生素C组]。四唑盐比色法测定细胞活性;流式细胞仪测定细胞的凋亡率、死亡率和胞内游离Ca⁺⁺的含量;酶法测定抗氧化酶(谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛)的含量及总抗氧化能力。结果 离体条件下扇贝多肽:①显着增强HeLa上皮细胞的活性;②降低HeLa上皮细胞的凋亡率和死亡率;③显着提高HeLa上皮细胞内游离Ca⁺⁺的含量;④提高细胞上清液中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性,降低丙二醛含量,且呈量效正比关系。结论 扇贝多肽在体外有抗UVB氧化损伤的作用。其作用机制可能是扇贝多肽通过提高抗氧化酶含量、清除自由基等,以减轻细胞凋亡而发挥其保护作用。     

卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子生成的影响

目的 探讨卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成的影响.方法 采用RT-PCR法检测原代培养的人角质形成细胞及COLO16细胞中VEGFmRNA的水平.结果 卡泊三醇作用于正常人角质形成细胞4h和24h后,以及作用COLO16细胞24h后,均可抑制VEGFmRNA的表达,呈剂量依赖性,IC₅₀值分别为1.19×10^-4μg/mL、1.51×10^-4μg/mL和3.16×10^-5μg/mL.维A酸作用于正常人角质形成细胞4h后可抑制VEGFmRNA的表达,作用于正常角质形成细胞24h后及作用于COLO16细胞4h和24h均无抑制作用.雷公藤内酯醇对正常角质形成细胞和COLO16细胞中VEGFmRNA表达均无抑制作用.结论 在转录水平抑制VEGF生成可能是维A酸与卡泊三醇抗银屑病的作用机制之一.     

反义蛋白激酶Cζ对角质形成细胞增殖的影响

目的 研究蛋白激酶C(PKC)ζ亚类在角质形成细胞增殖中的作用.方法 采用基因转染的方法将PKCζ基因导入角质形成细胞株Colo16中,初步研究了表达反义PKCζ对Colo16角质形成细胞增殖的影响.结果 表达反义PKCζ的角质形成细胞形态发生改变,生长速率明显减慢,被阻抑在G1期.结论 反义PKCζ抑制Colo16角质形成细胞的增殖.     

抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞凋亡的影响

目的 探讨抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对角质形成细胞凋亡的影响。方法 以不同浓度AK auto Ab作用体外培养人角质形成细胞后,用光镜及透射电镜观察细胞形态变化、用流式细胞仪分析细胞周期变化以及提取角质形成细胞DNA作电泳特征分析。结果 AK auto Ab作用后培养的角质形成细胞光镜、电镜下形态发生凋亡特有的改变,出现核固缩、染色质凝聚,并形成凋亡小体;细胞周期分析图中出现凋亡峰;DNA电泳呈有一定间隔的梯状条带。结论 AK auto Ab对角质形成细胞的凋亡具有诱导作用。     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

中波紫外线辐射损伤角质形成细胞的p53信号传导通路研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射对角质形成细胞p53信号传导通路的影响.方法 以20、60和120mJ/cm²UVB辐射培养的取自健康儿童包皮的正常人表皮角质形成细胞,应用RT-PCR和免疫印迹方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平,检测分析UVB辐射后2h、24h和48h,p53及其下游分子MDM2、p21、Bax和GADD45的表达.结果 不同剂量UVB辐射角质形成细胞后均可见p53表达水平持续性显著升高(P<0.05).低剂量UVB辐射角质形成细胞后,MDM2、p21、GADD45升高不明显(P>0.05),Bax不表达;UVB辐射剂量升至60mJ/cm²后,MDM2于辐射后2h短暂性显著升高,p21和Bax持续性显著升高.结论 UVB辐射激活了角质形成细胞的p53信号传导通路,p53下游分子的表达具有剂量依赖性和时相性.     

UVB与钙离子对体外培养人角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响

目的 研究中波紫外线(UVB)照射以及不同钙离子浓度对角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响.方法 通过改变培养基中的钙离子浓度以及采用不同剂量UVB照射体外培养的人角质形成细胞,在不同时间段以寻常型天疱疮(PV)或落叶型天疱疮(PF)血清作为一抗进行免疫荧光检测,观察寻常型天疱疮抗原(PVA)和落叶型天疱疮抗原(PFA)的表达情况;提取细胞或皮肤表皮组织蛋白质,用PV和PF血清进行免疫印迹检测.结果 无论是否增加钙离子浓度,体外培养人角质形成细胞间隙均可以检测到PV血清特异性着色.只有增加培养基中钙离子浓度后,形成的复层化角质形成细胞间隙才可以检测到PF血清特异性荧光着色.不同剂量UVB照射后的角质形成细胞均不产生PF血清的特异性着色.PF血清与160000条带反应,PV血清可与130000和160000两条带反应.结论 体外培养的单层或复层角质形成细胞均可以表达PVA,提高培养基中钙离子浓度可以诱导培养人角质形成细胞复层化并表达PFA,而UVB照射不能促使人角质形成细胞在体外培养条件下表达PFA.     

中波紫外线激活HaCaT细胞炎症信号通路的实验研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)对角质形成细胞(KC)炎症信号通路的影响.方法 UVB(40 mJ/cm²)照射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,分别于照射后0、10、30、60、120、240min收集细胞蛋白和核蛋白,蛋白质印迹法检测NF-κB信号传导通路中的重要分子-磷酸化IκB-α(P-IκB-α)、IκB-α和NF-κB p65蛋白的动态变化,以及MAPK家族的蛋白分子ERK1/2、p38、c-JNK等磷酸化激活的动态变化.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,UVB照射后0.5h IκB-α开始发生磷酸化和降解,在第2、4小时时更加明显;细胞核蛋白p65的量在照射后0.5h开始升高,在随后的2h时达到高峰.UVB照射后10 min HaCaT细胞内的ERK1/2、p38、c-JNK蛋白的磷酸化就开始增加.结论 UVB照射KC可激活细胞内的NF-κB及MAPK信号传导通路.     

Artificial human skin: cytokine, prostaglandin, Hsp70 and histological responses to heat exposure

Artificial human skin, Skin²™ (keratinocytes and fibroblasts) and EpiDerm™ (keratinocytes), was used to determine heat-induced release/accumulation of mediators of injury and repair. Skin² was exposed to 37 or 41–45°C for 90 min, followed by 37°C for 22.5 h. Media were analyzed for interleukin-1 (IL-1), prostaglandin-E₂ (PGE₂), thromboxane-B₂ (TxB₂) and nuclear matrix apparatus protein (NMAP, viability). Specimens were taken for microscopy. Media and lysates from Skin² and EpiDerm (37 and 45°C) were analyzed for IL-1, its soluble receptor (sIL-1RII), receptor antagonist (IL-1Ra), interleukin-6 (IL-6) and heat shock protein-70A (lysates only). Significant release of IL-1 and PGE₂ was detected only above 43°C, where viability deteriorated and histological damage (especially to keratinocytes) was observed. With both skin products, sIL-1RII release was heat-depressed. IL-1 and IL-1Ra were elevated in media and IL-1Ra appeared to lower the bioactivity of IL-1. Heat depressed IL-6 release from Skin² fibroblasts. IL-6 production and release were negligible with EpiDerm. Heat increased Hsp-70A in both products. We conclude keratinocytes and fibroblasts are not primary cytokine and prostaglandin sources in heatstroke (<44°C) but could be in evaporative cooling failure, focal hot spots, or systemic responses. Levels of IL-1Ra, PGE₂ and Hsp70A may be important markers of cell status.     

Skin commensals amplify the innate immune response to pathogens by activation of distinct signaling pathways

Little is known about the impact of different microbial signals on skin barrier organ function and the interdependency between resident microflora and pathogenic microorganisms. This study shows that commensal and pathogenic staphylococci differ in their ability to induce expression of antimicrobial peptides/proteins (AMPs) and activate different signaling pathways in human primary keratinocytes. Whereas secreted factors of skin commensals induce expression of the AMPs HBD-3 and RNase7 in primary human keratinocytes via Toll-like receptor (TLR)-2, EGFR, and NF-κB activation, those of pathogenic staphylococci activate the mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase/AKT signaling pathways and suppress NF-κB activation. Interestingly, commensal bacteria are able to amplify the innate immune response of human keratinocytes to pathogens by increased induction of AMP expression and abrogation of NF-κB suppression, suggesting that the two activation pathways can act in a synergistic way. These data indicate that commensal and pathogenic microorganisms evolved specific mechanisms to modulate innate immunity of the skin.     

金黄色葡萄球菌性超抗原诱发银屑病发病机理探讨

目的探讨金黄色葡萄球菌性超抗原诱发银屑病的机制。方法3H-TdR掺入法测定细胞增殖反应,亚二倍体细胞含量测定,片段化DNA分析,膜联蛋白V(AnnexinV)法测定细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。结果金黄色葡萄球菌肠毒素B活化的淋巴细胞培养上清液作用于角质形成细胞48h,可促进角质形成细胞增殖,诱导角质形成细胞表达HLA-DR和Fas抗原;再次加入上清液继续作用48h,则诱导角质形成细胞凋亡（P<0.01）。结论金黄色葡萄球菌肠毒素B作为超抗原活化T细胞,使之释放细胞因子,后者使角质形成细胞首先活化增殖,继而凋亡。     

Characterization of alpha- and beta-adrenergic agonist stimulation of adenylate cyclase activity in human epidermal keratinocytes in vitro

Adrenergic receptors are responsible for selective recognition and binding of catecholamines and may in turn have an effect on epidermal cell growth and maturation via adenosine-3',5'-monophosphate (cAMP). Using endogenous catecholamines and drugs specific for alpha- and beta-receptor subtypes, we have characterized the adrenergic receptor coupled to adenylate cyclase in cultured human epidermal keratinocytes. The relative potency order of stimulation of adenylate cyclase was: isoproterenol greater than epinephrine much greater than norepinephrine. The predominant adrenergic receptor is of the beta 2-subtype, as also confirmed by use of the selective antagonists propranolol, butoxamine, and atenolol. No evidence of alpha-adrenergic receptor mediation of adenylate cyclase was noted with the alpha 2-specific agonist, clonidine. Phenylephrine, the alpha 1-specific agonist, affected cAMP formation but this response could not be totally inhibited with prazosin, suggesting an unknown mechanism of action. Human keratinocytes retained the same beta-adrenergic receptor potency order properties throughout growth and maturation.     

Fibronectin in the skin of patients with allergic dermatitis

In the skin of healthy subjects linear deposits were found of fibronectin at the dermoepidermal junction and in the walls of blood vessels, and reticular deposits in the papillary and reticular layers of the skin. In the epidermis of 12 out of 51 patients with allergic contact dermatitis fibronectin deposits were found in relation to Langerhans cells and keratinocytes. This was not observed in the epidermis in healthy subjects. The authors suggest that fibronectin on the surface of Langerhans cells and keratinocytes may play a role in antigen presentation.