凋亡调控基因Bcl-2、Bax与肿瘤

对肿瘤的研究，学们一直试图阐明肿瘤细胞如何接受特异的增殖信号而无限增殖的机制。但近年来，由于分子生物学技术的发展和应用以及细胞凋亡概念的确立、细胞凋亡现象又广泛存在于个体发生、免疫过程及肿瘤形成中，因而细胞凋亡的研究成为学关注的热点，对细胞凋亡相关基因的研究正逐渐深入。本就抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的研究进展及与肿瘤的关系做一综述。     

内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl-2和Bax的表达情况。方法选用雌性白色豚鼠16只，随机分为实验组和对照组各8只，以钥孔蛾血蓝蛋白全身免疫后，实验组以相同抗原进行内耳免疫，对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水，在内耳免疫7d后处死动物，取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测内耳凋亡细胞，免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl-2和Bax的表达。结果透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变，而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞，血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞，TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征，对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性，而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达，FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl-2蛋白表达阴性，对照组的Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bcl-2蛋白表达阳性。实验组Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bax蛋白表达阳性，对照组只有螺旋神经节细胞Bax蛋白表达弱阳性，Corti器、侧壁表达阴性。结论内耳免疫反应可诱导细胞凋亡发生，Fas-FasL是此过程的信号转导途径之一，Bcl-2和Bax蛋白在其中起了重要调节作用。     

内耳免疫反应中细胞凋亡及Caspase-3动态表达的研究

目的:研究内耳免疫反应过程中是否存在细胞凋亡,以及细胞凋亡是否与Caspase3信号转导有关。方法:选用雌性白色豚鼠45只,随机分为实验组29只,对照组16只,以钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)全身免疫后,实验组以相同抗原进行内耳免疫,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),分别在内耳免疫术后1、3、5、7d和14d后处死动物,于免疫前及处死前行双侧听性脑干反应(ABR)测试。取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测内耳凋亡细胞,免疫组织化学检测内耳Caspase3的表达。结果:实验组豚鼠内耳免疫前、后反应阈比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01);对照组给药前、后比较反应阈无明显变化。实验组豚鼠内耳均存在TUNEL染色阳性细胞,并且TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征,而对照组仅在支持细胞、血管纹和螺旋神经节细胞中发现极少数TUNEL染色阳性细胞。Caspase3免疫组织化学染色实验组内耳从内耳免疫后5d开始出现阳性表达,而对照组表达阴性。结论:内耳免疫反应可以诱导细胞凋亡的发生;内耳免疫反应诱导细胞凋亡的发生中有Caspase3的激活。     

内耳免疫反应中的细胞凋亡活性及其与FasL表达的相关性

目的 观察内耳免疫反应过程中是否存在细胞凋亡以及细胞凋亡活性与FasL表达相关性。方法16只雌性白色豚鼠。随机分为实验组与对照组，每组各8只。所有动物均先以钥孔虫戚血蓝蛋白全身免疫。然后，实验组再以相同抗原进行单侧内耳局部免疫，对照组则于单侧内耳注射等量磷酸盐缓冲生理盐水。3天后处死动物，取内耳免疫侧（或对照注射侧）耳蜗制备石蜡切片，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术检测内耳细胞凋亡活性，免疫组化法检测内耳FasL表达水平。结果实验组动物内耳Cord器毛细胞、血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞中存在阳性着色的凋亡细胞，对照组豚鼠内耳则否。实验组动物内耳Corti、蜗管侧壁、螺旋神经节细胞FasL表达阳性。对照组则为阴性。结论 内耳免疫反应可诱导局部细胞凋亡活性增高，FasL在此过程中可能发挥重要作用。     

鼻息肉中诱导型一氧化氮合酶、Bax及Bcl-2的表达及相关性研究

目的:检测鼻息肉组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达及相关性。方法:30例鼻息肉组织,应用TUNEL方法检测其凋亡情况;免疫组织化学SABC法检测iNOS及Bax、Bcl-2的表达;western blot方法检测iNOS、Bax、Bcl-2的表达。结果:①TUNEL方法检测凋亡细胞位于鼻息肉表层上皮细胞及腺体上皮细胞,均为弱阳性。②免疫组织化学法检测iNOS、Bax、Bcl-2均表达于鼻息肉组织上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞和浸润的炎性细胞,阳性表达定位于细胞质,其中Bax表达为弱阳性,iNOS、Bcl-2表达为强阳性。③Western blot检测3种蛋白均有表达条带,iNOS、Bal-2条带清晰,Bax条带软弱,差异有统计学意义(P<0.01);iNOS与Bcl-2的灰度值比值呈正相关(r=0.851,P<0.01);iNOS与Bax的灰度值比值呈负相关(r=-0.714,P<0.01)。结论:鼻息肉组织中存在抗凋亡和促凋亡2种蛋白,iNOS抑制细胞凋亡,可能对鼻息肉的发生、发展起重要的促进作用。     

内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的　探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl 2和Bax的表达情况。方法　选用雌性白色豚鼠 16只 ,随机分为实验组和对照组各 8只 ,以钥孔血蓝蛋白全身免疫后 ,实验组以相同抗原进行内耳免疫 ,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水 ,在内耳免疫 7d后处死动物 ,取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术 (terminal deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling ,TUNEL)检测内耳凋亡细胞 ,免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl 2和Bax的表达。结果　透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变 ,而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞 ,血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞 ,TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征 ,对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性 ,而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达 ,FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl 2蛋白表达阴性 ,对照组的Corti器、侧壁和     

Bcl-2和Bax在自发性糖尿病小鼠耳蜗中的表达研究

目的观察自发性糖尿病小鼠耳蜗组织细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因的表达。方法非肥胖性糖尿病（non-obese,diabetes,NOD）雌鼠分为糖尿病4周组（D4组）、糖尿病12周组（D12组）和正常对照组（C组）。应用吖啶橙-碘化丙啶（AO-PI）荧光染色和DNA缺口末端原位标记法（TUNEL）检测耳蜗凋亡细胞;免疫组织化学法和Western blot技术检测Bcl-2和Bax在糖尿病耳蜗组织中的表达。结果 NOD小鼠耳蜗可见大量凋亡细胞,D12组比D4组明显增多（P〈0.05）;两组底回毛细胞较顶回凋亡率明显增高（P〈0.05）。D4组耳蜗中Bax在细胞浆内呈阳性表达,Bcl-2在细胞核及细胞浆内均呈阳性表达;D12组Bax在细胞核及细胞浆内均呈阳性表达,而Bcl-2在细胞浆内呈阳性表达;与C组比较,D4组Bax与Bcl-2表达显著增高（P〈0.05）,D12组Bax表达显著增高（P〈0.05）,但Bcl-2表达下调（P〈0.05）;D4组Bax表达较D12组显著降低（P〈0.05）,但Bcl-2表达较D12组显著增高（P〈0.05）。结论自发性糖尿病小鼠耳蜗存在明显细胞凋亡,其损伤机制与Bax表达增高及Bcl-2表达降低有关。     

细胞凋亡与激光对内耳损伤关系的研究

目的 研究激光对内耳的损伤过程中细胞凋亡最终是否参与,并探讨激光对内耳损伤的机制。方法 选用健康雄性听力正常的豚鼠24只,随机分成对照组及实验A、B、C组,每组6只。对照组只打开听泡暴露圆窗龛,实验组分别以平均功率为1W、3W及5W的超脉冲CO2激光在豚鼠左耳耳蜗底周造孔。术前1d和处死前分别检测豚鼠听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)。术后1d断头处死豚鼠,扫描电镜形态学观察,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果 实验B组和实验C组术后ABR III波阈值较术前提高(P<0.05)。实验C组外毛细胞纤毛散乱,并有散在缺失,实验B组外毛细胞纤毛稍散乱,无缺失,而对照组和实验A组基本正常。实验C组耳蜗螺旋神经节细胞、耳蜗神经细胞及外毛细胞等处见明显凋亡阳性细胞,实验B组上述部位仅见散在少量凋亡阳性细胞,而对照组和实验A组未见明显改变。结论 高峰功率激光对内耳的结构和功能有损伤,细胞凋亡在其中起了重要作用。     

内耳免疫反应中内耳血管细胞粘附分子-1和α4-整合素的表达

目的 探讨血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和α4-整合素(α4-Integrin)在内耳免疫反应中的作用。方法 采用钥孔戚血蓝蛋白激发已两次全身致敏的大鼠内耳，诱发其内耳免疫反应，制造迷路炎模型，然后通过免疫组织化学技术，检测内耳VCAM-1和α4-Intergrin分别在内耳中的表达。结果 内耳激发后24小时，螺旋轴静脉(spiral modiolar vein，SMVs)及其回流小静脉(collecting venules,CVs)可见有VCAM-1表达，48小时达最高峰，维持此水平1周，然后下降。α4-Intergrin在致敏后24小时即可表达于浸润于SMV8和CVs及蜗神经周围的白细胞，铝小时达高峰，然后迅速下降。结论 内耳免疫反应时VCAM-1、α4-Intergrin在炎性细胞从循环系统进入内耳的过程中发挥着重要作用。     

凋亡抑制蛋白Survivin及Bcl-2在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义

目的研究凋亡抑制蛋白Survivin及Bcl-2在中耳胆脂瘤上皮中的表达及相互关系,探讨其表达对胆脂瘤增殖能力的影响。方法运用免疫组织化学SP法检测21例胆脂瘤标本及11例外耳道骨部正常皮肤组织中Survivin、Bcl-2的表达。结果Survivin、Bcl-2在胆脂瘤上皮的表达与正常外耳道皮肤上皮比较,不仅范围广,基底上层也有表达,而且表达水平显著增高,两者比较有统计学意义(P<0.01)。胆脂瘤上皮中Survivin表达指数与Bcl-2表达指数呈正相关(r=0.553,P<0.01)。结论凋亡抑制蛋白Survivin,Bcl-2在中耳胆脂瘤的异常表达可能在胆脂瘤的发生、发展过程中起重要作用,它们可能参与胆脂瘤上皮的凋亡调控过程,因此适当控制Survivin,Bcl-2的表达可能会更有效地控制中耳胆脂瘤的发展。     

Antigen-specific immune response in the inner ear

The specificity of inner ear immune responses was investigated by challenging each inner ear of presensitized animals with different antigens. Animals presensitized systemically with keyhole limpet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin (BSA) were challenged with KLH in the right and BSA in the left inner ears. Two weeks later perilymph anti-KLH levels were increased significantly in the right inner ears compared to the levels in the left inner ears. In contrast, perilymph anti-BSA levels were increased significantly in the left inner ears compared to the levels in the right inner ears. These results suggested that the rise in perilymph antibody following inner ear antigen challenge was predominantly the result of an antigen-specific immune response in the inner ear and not simply the result of an increase in vascular permeability of serum contamination from the experimental procedure itself.     

Transforming growth factor beta expression during an inner ear immune response

OBJECTIVES: The involvement of transforming growth factor beta (TGF-beta), a strong mediator of fibrogenesis, during cochlear immune responses was investigated. METHODS: An inner ear adaptive immune response to antigen was created in mice that were painlessly sacrificed 3 to 48 hours and 7 days after initiation of the immune response. The cochleas were assayed by immunocytochemistry for TGF-beta and latency-associated peptide (LAP). RESULTS: We found LAP expressed in normal cochleas and the endolymphatic sac, in the small round cells in the cochlear scalae and the mesothelial cells under the basilar membrane, and in the endolymphatic sac perisaccular area. We found TGF-beta expressed in infiltrated, inflammatory cells in the scalae and the endolymphatic sac lumen 3 hours after cochlear antigen challenge. At this time, LAP immunoreactivity was decreased. This rapid shift in immunoreactivity provides evidence for activation of TGF-beta during an immune response. This reversal of expression persisted for 48 hours, but conditions reverted to normal after 7 days. Surgical controls did not show TGF-beta expression. CONCLUSIONS: We conclude that TGF-beta activation occurs in the early phase of a cochlear adaptive immune response and is down-regulated as the response resolves. This finding suggests that the process of cochlear fibrosis starts early and that proper treatment could prevent cochlear fibrosis.     

Role of lymphokines in the immune response of the inner ear

In secondary inner ear responses against keyhole limpet hemocyanin (KLH), the characterization of interleukin-2 levels in perilymph and serum developing over 5 days in Hartley guinea pigs was investigated using an immunoassay. No interleukin-2 levels were detectable at Day 0 in serum and perilymph. The earliest perilymph IL-2 levels were observed after 6 h, peaking at 18 h and decreasing to zero by Day 5. In contrast, during this observation period, no IL-2 was detectable in serum or perilymph from control ears. Since previous work has identified T-helper cells in the endolymphatic sac, this site appears to be the probable source of interleukins. This study provides further support for the existence of an inner ear immune response which is regulated by lymphokines. Furthermore, interleukins may be a chemoattractant for cells entering the cochlea during the immune response.     

内耳免疫应答过程中内淋巴囊的细胞增殖

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内耳免疫反应时血清及外淋巴液IL-6水平的测定及其意义

为了解在用ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ引发的大鼠继发性内耳免疫反应时，实验动物血清及外淋巴液中是否有细胞因子活性的变化，采用免疫测定方法对实验动物血清及外淋巴液中白细胞介素活性进行测定。结果；在发生继发性内耳反应初始，外淋巴液未检测到ＩＬ－６，而６ｈ后外淋巴液中检测到了ＩＬ－６的最早水平，２４后ＩＬ－６水平达到最高峰。     

细胞间粘附分子-1在内耳免疫反应中的表达

目的探讨细胞间粘附分子１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ１，ＩＣＡＭ１）在内耳免疫反应中的作用。方法采用钥孔血蓝蛋白激发已全身致敏的２６只大鼠内耳，诱发其内耳免疫反应，然后通过免疫组化技术检测内耳的ＩＣＡＭ１的表达。结果内耳激发后６小时，螺旋轴静脉及其回流小静脉即有ＩＣＡＭ１表达，１２小时内淋巴囊及其囊周区出现ＩＣＡＭ１表达，在２４～４８小时内耳各部位ＩＣＡＭ１表达达最高峰。７２小时各种炎性细胞浸润到内耳的各个部位。随后ＩＣＡＭ１表达逐渐减弱，２８天完全消失。结论内耳免疫反应时，ＩＣＡＭ１在炎性细胞从循环系统进入内耳的过程中发挥着重要作用，调控ＩＣＡＭ１表达的细胞因子也可能还来自内淋巴囊以外的其他细胞。