ID3基因在逆转骨肉瘤顺铂耐药中的作用及其机制的研究

目的 探讨ID3基因在逆转骨肉瘤顺铂耐药中的表达及对骨肉瘤细胞耐药、凋亡及RhoE、P-gp、Cas-pase-3表达的影响.方法 MTT法检测顺铂处理对U-2 OS及U-2 OS/DDP细胞生长功能的影响,qRT-PCR及Western blot法检测U-2 OS及U-2 OS/DDP细胞中ID3的表达;用ID3过表达载体转染U-2 OS/DDP细胞,以空脂质体转染的细胞作为对照组,各组细胞培养24 h后,用Western blot法检测细胞中RhoE、P-gp、Caspase-3蛋白表达变化;MTT检测耐药细胞耐药性的逆转作用;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 顺铂耐药株U-2 OS/DDP细胞耐药能力明显高于U-2 OS细胞;ID3在顺铂耐药株U-2 OS/DDP细胞表达水平低于U-2 OS细胞;ID3基因过表达对骨肉瘤细胞耐药性具有逆转作用;ID3基因过表达可促进U-2 OS/DDP细胞凋亡;ID3过表达后,P-gp的表达下调,RhoE和Caspase-3的表达上调,差异有统计学意义(P﹤0.05).结论 ID3基因在顺铂耐药株U-2 OS/DDP细胞中表达水平较低,过表达ID3基因能逆转U-2 OS/DDP细胞耐药情况,并通过调节RhoE、P-gp、Caspase-3蛋白表达促进细胞凋亡,其可能的机制与耐药蛋白的调控有关.     

二甲双胍逆转人卵巢癌细胞株对顺铂耐药的实验研究

目的 探讨二甲双胍对人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3／DDP的耐药逆转作用及机制。方法 将人卵巢癌细胞株SKOV3细胞设为亲本组,耐顺铂细胞株SKOV3／DDP细胞分为空白对照组、顺铂组、二甲双胍组和联合用药组（顺铂+二甲双胍组）;采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍对SKOV3／DDP细胞的作用,RT-PCR和Western blotting检测各组细胞中内质网应激相关蛋白的表达。结果 不同浓度二甲双胍作用24h后,对SKOV3细胞和SKOV3／DDP细胞均有抑制作用,且呈浓度依赖性（P＜0.05）;当二甲双胍＞5 mmol／L时,其对SKOV3／DDP细胞的增殖抑制率高于SKOV3细胞（P＜0.05）。顺铂对SKOV3细胞和SKOV3／DDP细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为15.25 μg／ml和118.68 μg／ml,SKOV3／DDP的耐药倍数为7.78。联合用药组SKOV3／DDP细胞IC50为 73.45 μg／ml,耐药倍数为4.81。二甲双胍对SKOV3／DDP细胞对顺铂耐药性的逆转倍数为1.62。亲本组中GRP78 mRNA和蛋白的相对表达水平分别为0.38±0.02和0.24±0.04;顺铂组、二甲双胍组和联合用药组的GRP78 mRNA的相对表达水平分别为0.93±0.02、0.68±0.02、0.49±0.07,与空白对照组的0.83±0.04比较,联合用药组明显降低,其次为二甲双胍组,顺铂组升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）;GRP78蛋白在各组中表达与其mRNA表达趋势一致,差异均有统计学意义（P＜0.05）。顺铂组、二甲双胍组、联合用药组CHOP蛋白的表达量分别为0.42±0.03、0.69±0.03、0.84±0.01,均高于空白对照组的0.39±0.05,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 二甲双胍对人卵巢癌顺铂耐药细胞的耐药性有调节作用,其可能作用机制为通过降低GRP78表达,提高CHOP蛋白表达的内质网应激途径促进细胞凋亡来降低耐药细胞对顺铂的耐药性。     

FOXO3a 在缺氧诱导骨肉瘤U-2OS细胞顺铂耐药中的作用

目的：探讨FOXO3a 在缺氧诱导骨肉瘤细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药中的作用。方法：利用RT-PCR和Western blotting方法检测人骨肉瘤细胞U-2OS在常氧及缺氧条件下FOXO3a 的表达水平,Western blotting 检测转染FOXO3a-siRNA 和HIF-1α-siRNA 对细胞内FOXO3a 和HIF-1α 表达的影响,CCK-8 和Annexin V/PI 染色法检测FOXO3a 在缺氧诱导骨肉瘤细胞DDP耐药中的作用。结果：缺氧可使人骨肉瘤细胞U-2OS中FOXO3a mRNA和蛋白表达升高（均P<0.05）。FOXO3a 的表达受HIF-1α调控,与正常细胞组和转染阴性序列HIF-1α-NC组相比,HIF-1α-siRNA 组FOXO3a 蛋白表达量均显著降低[(0.38±0.03) vs (0.89±0.08),(0.91±0.07),均P<0.01]。在缺氧条件下,FOXO3a-siRNA 可降低U-2OS 细胞对DDP 的耐受性[(38.50±2.83)% vs (61.75±5.73)%,P<0.01],增加DDP诱导的U-2OS细胞凋亡[(73.41±6.13)% vs (32.38±2.23)%, (55.89±4.46)%,均P<0.05]。结论：缺氧通过HIF-1α 依赖的方式诱导骨肉瘤细胞内FOXO3a 表达,从而增强瘤细胞对DPP的耐药性。     

CXCL4对非小细胞肺癌H460细胞顺铂耐药性的影响及其机制探讨

目的:探讨血小板因子4（CXCL4）对人非小细胞肺癌H460细胞顺铂耐药性的影响及其作用机制。方法:体外诱导法建立顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞株H460/DDP,并鉴定其生物学特性。采用CCK-8法分别检测H460及H460/DDP对顺铂的耐药性。qRT-PCR及Western Blot检测亲本细胞株H460及顺铂耐药株H460/DDP中CXCL4的mRNA及蛋白表达水平。通过CCK-8法检测过表达或者敲低CXCL4后亲本细胞株H460或顺铂耐药株H460/DDP对顺铂的敏感性。最后利用Western Blot及qRT-PCR法探讨CXCL4抵抗非小细胞肺癌化疗敏感性的调控机制。结果:成功构建了非小细胞肺癌顺铂耐药株H460/DDP（H460/DDP IC50=55.005 μg/ml）,CCK-8结果提示顺铂耐药株H460/DDP与亲本细胞株H460细胞的增殖速度没有明显差异（P＞0.05）;顺铂耐药株H460/DDP中,CXCL4 mRNA及蛋白水平均显著增高（P＜0.000 1）;在亲本细胞株H460中稳定过表达CXCL4能显著降低其对顺铂的敏感性（P＜0.000 1）,而于顺铂耐药株H460/DDP中敲低CXCL4能显著增加H460/DDP对顺铂的敏感性（P＜0.000 1）;Western Blot及qRT-PCR结果显示,CXCL4能激活Wnt/β-catenin 信号通路,促进下游基因MYC、CyclinD1、MMP-7、CDK4的表达。结论:CXCL4通过调控Wnt/β-catenin 信号通路促进非小细胞肺癌对顺铂的耐药性。     

转染Livin基因后骨肉瘤细胞系的多药耐药性研究

目的:探讨转染Livin基因后人骨肉瘤细胞的多药耐药变化.方法:采用基因重组技术构建Livin 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin ,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Livin基因的表达载体转染人骨肉瘤细胞U-2OS,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性.结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin 构建成功.将该表达载体转染U-2OS细胞后,Livin基因的表达水平与野生型U-2OS细胞和转染空载体的U-2OS/neo细胞相比显著提高(P<0.01) .与U-2OS细胞和U-2OS/neo细胞相比,U-2OS/Livin细胞对ADM、CTX、MMC和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0.01).结论:Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一.     

WP1130通过下调β-catenin增强鼻咽癌细胞化疗敏感性

摘 要：［目的］探讨WP1130与顺铂联合用药对鼻咽癌细胞增殖和转移的影响及其可能机制。［方法］ CCK-8法检测鼻咽癌顺铂敏感细胞系HNE1和顺铂耐药细胞系HNE1/DDP的顺铂药物半抑制浓度（IC50）,以及不同浓度WP1130对鼻咽癌细胞活力的影响;选取适当药物浓度处理细胞,两种鼻咽癌细胞系分别分为4组：空白对照组（DMSO）、DDP单药组（6 ?滋mol/L顺铂）、WP1130单药组（1.25 ?滋mol/L WP1130）以及DDP+WP1130联合用药组（6 ?滋mol/L顺铂+1.25 ?滋mol/L WP1130）。MTT法检测鼻咽癌细胞增殖能力;细胞划痕实验检测鼻咽癌细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测鼻咽癌细胞侵袭能力;RT-PCR和Western blot实验检测顺铂耐药HNE1/DDP与亲本HNE1鼻咽癌细胞中β-catenin的表达情况以及不同药物处理对β-catenin的表达的影响。［结果］ 耐药HNE1/DDP细胞比亲本HNE1细胞对顺铂的耐受性提高了近5.7倍（5.17±0.33 vs 29.44±2.62,P＜0.01）。β-catenin在HNE1/DDP细胞中的mRNA表达上调约3.4倍（1.00±0.26 vs 3.44±0.39,P＜0.01）。与空白对照组和单药组相比,顺铂+WP1130联合用药组细胞中β-catenin的表达显著下调（HNE1：1.00±0.06 vs 0.78±0.07 vs 0.32±0.05,P＜0.05;HNE1/DDP：1.01±0.05 vs 0.57±0.07 vs 0.39±0.07,P＜0.05）,顺铂+WP1130联合用药组细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P均＜0.01）。［结论］ WP1130与顺铂联合用药可以通过下调β-catenin的表达增强顺铂对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,从而增强鼻咽癌细胞的化疗敏感性。     

GRP78在不同亚型宫颈癌细胞株中表达情况及对顺铂敏感性影响

目的：研究不同亚型宫颈癌细胞株中葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78,GRP78）表达情况，以及GRP78表达水平对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响。方法：采用免疫组织化学法检测人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16（+）SiHa、HPV18（+）HeLa以及HPV（-）C33a宫颈癌细胞中的GRP78表达，MMT、Western blot法检测以上3种细胞在不同浓度顺铂、衣霉素+顺铂处理后的细胞抑制率及GRP78表达水平，采用单因素方差分析，分析相同浓度下单用顺铂、衣霉素+顺铂联合处理后3种细胞的细胞抑制率及GRP78蛋白表达的差异。结果：SiHa、HeLa细胞GRP78阳性表达水平明显高于C33a细胞，SiHa细胞GRP78阳性表达水平最高（P＜0.01）。随着顺铂浓度增加，3种宫颈癌细胞抑制率增加呈浓度依赖性，且HeLa细胞抑制率最高（P＜0.05）。与单独顺铂组相比，衣霉素联合顺铂药物处理组中HeLa及SiHa细胞抑制率显著升高（P＜0.05），并且GRP78表达水平也明显升高（P＜0.01），且各细胞株中GRP78表达水平均随顺铂浓度增加而增加。结论：GRP78表达水平与宫颈癌细胞亚型有关，SiHa、HeLa细胞对顺铂敏感性高于C33a细胞。衣霉素导致GRP78明显高表达，增加了SiHa、HeLa细胞对顺铂的敏感性。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞中核糖体蛋白基因的表达谱分析

目的研究核糖体蛋白基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达.方法以顺铂为诱导剂,采用中等剂量、间歇作用法建立人卵巢癌顺铂耐药细胞系COC1/DDP,然后以其亲本细胞COC1为对照,应用cDNA微阵列检测COC1/DDP细胞的核糖体蛋白基因表达.结果与COC1细胞相比,COC1/DDP细胞对顺铂有6.2倍耐药性,细胞倍增时间延长了8.9 h,S期细胞减少了(27.4±2.13)%,而G1和G2期细胞分别增加了(19.6±3.71)%和(8.3±1.95)%.在143个表达水平发生改变的基因中,有12个核糖体蛋白基因表达下调,多个凋亡抑制基因表达上调,凋亡诱导基因CASP2表达下调.结论 COC1/DDP细胞对顺铂具有耐药性,耐药性的产生可能与部分核糖体蛋白基因的表达下调有关.     

MK2206对三阴性乳腺癌顺铂耐药细胞增殖及耐药性的影响

摘 要：［目的］探讨Akt抑制剂MK2206对三阴性乳腺癌顺铂耐药细胞株MDA-MB-231/DDP生长活性及耐药性的影响。［方法］ 使用不同浓度梯度的顺铂（DDP）、MK2206单药或联合作用于MDA-MB-231/DDP细胞,MTT法检测各药物对细胞的增殖抑制率;高效液相色谱法检测细胞内DDP药物浓度的改变;Western Blot、Real-time PCR分别检测细胞内Akt蛋白及MDR相关基因（MDR1、BCRP、MMP7、GST-π）的表达水平。［结果］ MK2206单药对MDA-MB-231/DDP细胞有明显的抑制作用,无毒剂量的MK2206可明显增强MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的敏感性,增加细胞内顺铂浓度,使细胞内Akt蛋白及MDR相关基因（MDR1、BCRP、MMP7、GST-π）的表达水平明显降低。［结论］ MDA-MB-231/DDP细胞的顺铂耐药性与细胞内Akt蛋白的过度表达有关,MK2206有明显的顺铂增敏作用,能部分逆转MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的耐药性,其机制可能与降低细胞内MDR1、BCRP、MMP7、GST-π的基因表达水平有关。     

自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制

目的 研究自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制。方法 CCK-8法检测细胞IC50;将Y79细胞随机分为对照组（Control）、顺铂组（Cis）和顺铂联合应用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤组（Cis+3-MA）,Western blot法、细胞自噬染色检测试剂盒（MDC法）和透射电子显微镜观察细胞自噬情况;CCK-8法检测顺铂对细胞的抑制率变化,Annexin V/PI双染流式法检测细胞凋亡变化,q-PCR检测相关耐药基因转录水平,Fluo-4 AM钙离子荧光探针染色检测细胞内钙离子变化,Western blot法检测CaMKK2、p-AMPK、mTORC1、LC3Ⅱ的表达。结果 视网膜母细胞瘤Y79细胞在顺铂的诱导下发生自噬,加入自噬阻断剂3-MA后细胞自噬水平下调。与顺铂组相比,Cis+3-MA组顺铂抑制率增加,凋亡率增加,相关耐药基因转录水平下调。细胞加入顺铂后,细胞内钙离子水平增加,CaMKK2、p-AMPK、LC3Ⅱ表达上调,mTORC1表达下调。结论 顺铂诱导肿瘤细胞产生的自噬对视网膜母细胞瘤细胞Y79耐药起保护作用,抑制自噬可以改善肿瘤细胞对顺铂的耐药性。顺铂可能是通过Ca2+激活CaMKK2/AMPK/mTORC1通路诱导Y79细胞自噬。     

RAIDD expression is impaired in multidrug resistant osteosarcoma cell lines

Purpose  To identify the apoptosis genes involved in the multidrug resistant phenotype of osteosarcoma. Methods  Multidrug resistant human osteosarcoma cell line (U-2 OS MR) and a drug sensitive parental cell line (U-2 OS) were both treated with paclitaxel and analyzed by the gene array containing 96 apoptosis associated genes. The different expression of the special apoptosis associated genes were further analyzed by Western blot in the multidrug resistant osteosarcoma cell lines (U-2 OS MR, KH OS R2) and the drug sensitive parental cell lines (U-2 OS, KH OS). One of the disregulated gene, RAIDD, was transfected into the multidrug resistant osteosarcoma cells for functional studies. Results  RAIDD showed signs of significant expression in the U-2 OS cells after being treated with paclitaxel (P < 0.01). However, the induction of RAIDD did not occur in U-2 OS MR cells (P = 0.2). Subsequent analysis by Western blot confirmed the deficiency of the expression of RAIDD protein in U-2 OS MR. On the contrary, the expression of RAIDD could be significantly induced by paclitaxel and doxorubicin in U-2 OS cells as both time and dosage were deciding factors. It also demonstrated the cleavage of PARP associated with RAIDD expression in U-2 OS cells, but not however in U-2 OS MR cells after being treated with paclitaxel or doxorubicin. Similar results were found in osteosarcoma multidrug resistant cell line KH OS R2 and the drug sensitive parental cell line KH OS. Furthermore, over-expression of RAIDD in multidrug resistant cell lines could possibly reverse drug resistant phenotypes. Conclusion  This study indicate that impaired expression of RAIDD in drug induced apoptosis may play a role in the multidrug resistance of osteosarcoma cells.     

RIPK4在骨肉瘤组织和细胞中的表达及其意义

目的研究RIPK4（Receptor-interacting protein kinase 4）基因在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞中的表达情况并探讨其表达的临床意义。方法 采用免疫组化染色法检测30例骨肉瘤及10例骨软骨瘤患者瘤组织中RIPK4表达情况,分析其表达与骨肉瘤临床病理特征的关系;RT-PCR检测正常成骨细胞、骨肉瘤MG-63及U-2OS细胞中RIPK4 mRNA表达情况,并比较其差异。结果 30例骨肉瘤中RIPK4阳性表达18例（60.0％）,10例骨软骨瘤中RIPK4阳性表达2例（20.0％）,差异有统计学意义（P＜0.05）。正常成骨细胞中RIPK4 mRNA为0.6500±0.2121,低于骨肉瘤MG-63细胞的1.6079±0.2661及U-2OS细胞的1.5000±0.1414,差异有统计学意义（P＜0.05）。RIPK4蛋白表达与临床分期及是否发生肺转移显著相关,差异有统计学意义（P＜0.05）,而与性别、年龄及病理分型等无关（P＞0.05）。结论 RIPK4 mRNA和蛋白在骨肉瘤组织及细胞中均有较强表达,RIPK4基因可能参与骨肉瘤的发生发展过程。     

lncRNA HIT对骨肉瘤组织和细胞U2OS顺铂抵抗的影响及其机制

目的:探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）HIT与骨肉瘤细胞顺铂（cisplatin,DDP）抵抗的关系及其上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的相关机制。方法：选择天津医院骨科2017 年6 月至2018 年6 月42 例骨肉瘤组织及相应癌旁组织（距癌变边缘>5 cm）标本,采用qRT-qPCR 检测骨肉瘤组织及相应癌旁组织中HIT 及EMT标志物Snail、E-钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表达水平。构建DDP抵抗的人骨肉瘤U2OS细胞株及人肾上腺293T细胞株作为抵抗组及对照组,采用慢病毒转染两组表达靶向HIT的siRNA载体于抵抗组细胞中作为干扰A组及B组,同时转染HIT过表达载体及空白载体构建HIT 过表达的U2OS细胞株及空白U2OS细胞株分别作为过表达组及空白组。MTT实验检测各组细胞DDP半抑制浓度（IC50）,qRT-PCR实验检测各组细胞中HIT、Snail 及E-cadherin mRNA的表达水平,Western blotting 检测各组细胞Snail 及Ecadherin的表达水平,RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-IP）实验检测U2OS 及293T 细胞中HIT 与Snail 蛋白分子的结合情况。结果：骨肉瘤组织中HIT及Snail mRNA表达显著高于癌旁组织、E-cadherin mRNA表达显著低于癌旁组织,且骨肉瘤组织中HIT与E-cadherin mRNA表达呈显著负相关(均P<0.01);抵抗组细胞DDP IC50显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组DDP IC50显著高于空白组(均P<0.01);抵抗组细胞HIT 表达显著高于对照组,干扰A组及B组细胞HIT 表达显著低于抵抗组及对照组,过表达组HIT表达显著高于空白组（均P<0.05 或P<0.01）;抵抗组细胞Snail 、E-cadherin mRNA表达水平显著高于或低于对照组、干扰A组及干扰B组,过表达组E-cadherinmRNA显著低于空白组;抵抗组细胞Snail 蛋白表达水平显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,E-cadherin 蛋白表达水平则显著低于对照组、干扰A 组及B 组细胞,过表达组Snail 蛋白表达水平显著高于空白组(P<0.05或P<0.01）;在U2OS及293T细胞中,免疫磁珠介导Anti-snail 抗体下拉HIT的表达水平显著高于对照IgG抗体下拉HIT的表达水平（P<0.01）。结论：HIT通过正调控Snail蛋白水平,抑制E-cadherin的转录活性,从而促进骨肉瘤细胞EMT及DDP抵抗的发生。     

lncRNA RHPN1-AS1靶向miR-485-5p调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及其分子机制

目的:探讨lncRNA RHPN1反义RNA1（RHPN1-AS1）靶向miR-485-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和机制。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测20例骨肉瘤组织与其对应的癌旁组织、人正常成骨细胞hFOB1.19以及3种骨肉瘤细胞（U-2OS、SAOS-2、HOS）中RHPN1-AS1和miR-485-5p的表达水平。利用脂质体转染法将RHPN1-AS1小干扰RNA（si-RHPN1-AS1）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、miR-485-5p模拟物（miR-485-5p mimics）、miRNA阴性对照（miR-NC）分别转染U-2OS细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印记（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、p27、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶14（MMP-14）蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证RHPN1-AS1和miR-485-5p的靶向调控关系。结果:与癌旁组织比较,骨肉瘤组织中RHPN1-AS1的表达水平显著升高,miR-485-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）;与hFOB1.19细胞比较,3种骨肉瘤细胞中RHPN1-AS1的表达水平显著升高,miR-485-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）。与si-NC组比较,si-RHPN1-AS1组U-2OS细胞的活力显著降低,迁移和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表达水平显著降低,p21、p27和Bax蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）;与miR-NC组比较,miR-485-5p组U-2OS细胞的活力显著降低,迁移和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平显著降低,p21和Bax蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。RHPN1-AS1靶向负性调控miR-485-5p表达。干扰miR-485-5p表达逆转了抑制lncRNA RHPN1-AS1表达对骨肉瘤U-2OS细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结论:抑制RHPN1-AS1通过上调miR-485-5p抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。     

KISS1 expression in osteosarcoma: high in chinese clinical cases, but lower in cell lines

Purpose: Osteosarcoma is the most common primary bone malignancy with a notorious feature of high metastasis. KISS1 has been identified as a putative human metastasis suppressor gene in numerous types of cancer. This study was aimed to evaluate the relationship between expression of KISS1 and invasion ability in osteosarcoma cell lines, and the relationships between KISS1 expression levels and prognosis of clincial cases. Methods: Expression levels of KISS1 in 3 types of osteosarcoma cell lines (MG-63, Saos-2 and U-2 OS) and a normal osteoblast cell line (hF-OB 1.19) were examined using semi-quantitative RT-PCR and immunochemistry staining. Transwell assays were used to detect the cell invasion ability. The osteosarcoma cell lines and specimen sections of osteosarcoma together with control were immuno-stained with KISS1 antibody. The relationship between the clinical data and the expression of KISS1 was evaluated. Results: KISS1 mRNA expression was moderate in U-2 OS, weak in Saos-2 and lost in MG-63. Transwell assays displayed a gradually increased aggressive phenomenon in osteosarcoma cell lines U-2 OS, Saos-2 and MG-63. However, a contrary conclusion was obtained with clinical specimen, a higher positive rate of KISS1 expression being displayed in osteosarcoma patients, especially in metastastic cases, compared to the benign osteochondroma patients. Furthermore, significant earlier distant metastasis was observed in KISS1 positive than negative cases. Conclusion: KISS1 expression levels were found to be decreased with the increasing aggressive ability in osteosarcoma cell lines. However, expression of KISS1 positively correlated with metastasis in osteosarcoma patients.     

Antitumor effect of nutrient synergy on human osteosarcoma cells U-2OS, MNNG-HOS and Ewing's sarcoma SK-ES.1

Current treatment of osteosarcoma is associated with poor prognosis, especially due to the increased risk of developing other cancers with chemotherapy. Therefore, new, safe and effective treatment strategies are needed. We investigated the effect of a unique mixture of nutrients containing lysine, proline, arginine, ascorbic acid, and epigallocatechin gallate (EGCG) on human osteosarcoma cell lines U-2OS, MNNG-HOS, and Ewing's sarcoma SK-ES-1 by measuring: cell proliferation, expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, and invasive and angiogenesis potential. Cell proliferation was evaluated by MTT assay, matrix metalloproteinases (MMP) expression by gelatinase zymography, VEGF expression by ELISA, and invasion through Matrigel. Cells were also treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to study enhanced MMP and VEGF expression. The invasion of osteosarcoma U-2OS and MNNG-HOS cells through Matrigel was significantly reduced in a dose-dependent fashion, with 100% inhibition of invasion of U-2OS cells at 100 microg/ml, and MNNG cells at 50 microg/ml concentration of the synergistically acting nutrient mixture. Ewing's sarcoma SK-ES-1 cells were not invasive. Nutrient synergy (NS) exhibited a dose response antiproliferative effect on osteosarcoma U-2OS cells, reaching 67% at 1000 microg/ml of NS; no significant suppression of cell proliferation was seen with MNNG or Ewing's sarcoma cells. Zymography showed dose-dependent inhibition of MMP secretion by all three cell lines in the presence of NS. VEGF secretion by U-2OS cells was completely blocked at 500 microg/ml of NS. Our results suggest NS is an excellent candidate for therapeutic use in the treatment of osteosarcoma, by inhibiting cancer cell invasion, and secretion of MMPs and VEGF, all critical parameters for cancer control and prevention.