CircPIP5K1A靶向调节miR-101-3p影响结直肠癌SW480细胞生长、迁移、侵袭和凋亡的作用机制

目的 探究CircPIP5K1A靶向调节miR-101-3p对结直肠癌(CRC)SW480细胞生长、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 qRT-PCR检测人CRC组织、邻近正常组织、CRC细胞株SW480、正常结肠上皮细胞FHC中CircPIP5K1A、miR-101-3p水平;将si-NC、si-CircPIP5K1A、si-CircPIP5K1A+inhibitor NC、si-CircPIP5K1A+miR-101-3p inhibitor分别转染至SW480细胞并命名为si-NC组、si-CircPIP5K1A组、si-CircPIP5K1A+inhibitor NC组、si-CircPIP5K1A+miR-101-3p inhibitor组,未做任何处理的SW480细胞记为NC组。双荧光素酶报告基因实验验证CircPIP5K1A与miR-101-3p的关系;qRT-PCR检测SW480细胞中CircPIP5K1A、miR-101-3p表达;CCK-8法检测SW480细胞增殖情况;流式细胞术检测SW480细胞凋亡率;Transwell检测SW480细胞侵袭、迁移数量;Western ...     

LncRNA KCNQ1OT1调节miR-145/PAK4轴对结直肠癌SW480细胞恶性发展的影响

目的:探究LncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌SW480细胞中的作用及其潜在的分子机制。方法:miRanda与TargetScan分别分析LncRNA KCNQ1OT1与miR-145的作用靶点。通过双荧光素酶报告基因实验验证相关的分子间靶标关系。qRT-PCR实验分析KCNQ1OT1、miR-145和PAK4在结直肠癌组织、癌旁组织、SW480细胞和CCC-HIE-2细胞中的基因表达量。将SW480细胞分为siRNA NC组、KCNQ1OT1 siRNA组、PAK4 siRNA组、inhibitor NC组、miR-145 inhibitor组、pcDNA-3.1(+)+mimics NC组、pcDNA-KCNQ1OT1+mimics NC组、pcDNA-3.1(+)+miR-145 mimics组、pcDNA-KCNQ1OT1+miR-145 mimics组，分别敲低KCNQ1OT1、miR-145和PAK4表达，MTT实验分析细胞活力，细胞克隆形成实验分析细胞克隆数目，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测SW480细胞EMT能力。结果:与癌旁组织相比(1.3...     

miR-1229-5p对人结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用研究全文替换

目的：探讨miR-1229-5p对SW480细胞生物学功能的影响和作用机制。方法：采用瞬时转染在SW480细胞中过表达miR-1229-5p,进行细胞克隆、EdU实验、MTT、细胞划痕、Transwell小室迁移及侵袭实验,检测miR-1229-5p mimics组与对照组结直肠癌细胞SW480生物学功能变化。转染过表达miR-1229-5p慢病毒后进行裸鼠皮下成瘤实验,观察miR-1229-5p在体内对细胞增殖能力的影响。通过预测软件TargetScan筛选出X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)作为miR-1229-5p的潜在下游靶基因,并检测miR-1229-5p对其蛋白表达的影响。在SW480细胞中转染XAF1过表达质粒,共转染miR-1229-5p后进行回复实验验证miR-1229-5p通过靶向XAF1促进SW480细胞增殖及侵袭。结果：miR-1229-5p mimics组较miR-NC组细胞的增殖、迁移及侵袭能力均提高(P<0.01);miR-1229-5p组瘤体体积高于miR-NC组(P<0.01);miR-1229-5p组对靶基因XAF1表达量低于miR...     

miR-23a调控ESRP1干预直肠癌细胞增殖和凋亡

目的 分析微小RNA-23a （microRNAs-23a,miR-23a）在直肠癌组织及细胞系中的相对表达水平,以及miR-23a对直肠癌细胞增殖和凋亡的作用,并分析其可能作用机制。方法 采用qRT-PCR检测miR-23a在36例直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平;利用qRT-PCR检测miR-23a在直肠癌SW480细胞及人正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达;合成miR-23a抑制剂（inhibitor） RNA片段和抑制剂阴性对照RNA片段（inhibitor negative control,inhibitor NC）,并将其分别转染至SW480细胞后,通过CCK-8法检测miR-23a inhibitor转染SW480细胞后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率;Western blot法检测上皮剪接调节蛋白1（epithelial splicing regulatory protein 1,ESRPl）蛋白在SW480细胞中的表达水平;构建野生型pGL3-ESRP1-3''UTR （wt-pGL3-ESRP1-3''UTR）或突变型pGL3-ESRP1-3''UTR （mut-pGL3-ESRP1-3''UTR）质粒,HEK293和SW480细胞经上述质粒分别与miR-23a inhibitor或inhibitor NC共转染后测定双荧光素酶活性。结果 与癌旁正常组织相比较,miR-23a在直肠癌组织中的相对表达水平明显上调,差异有统计学意义（P=0.000）;与NCM460细胞相比较,miR-23a在SW480细胞中的表达量显著上调,差异有统计学意义（P=0.000）;SW480细胞转染miR-23a inhibitor后,细胞增殖较inhibitor NC组下降35.54%±5.27%,两组结果差异有统计学意义（P=0.000）;转染miR-23a inhibitor后SW480细胞早期凋亡率明显高于inhibitor NC组（P=0.000）;荧光素酶报告基因结果表明ESRP1是miR-23a的直接靶基因;SW480细胞转染inhibitor NC后对ESRP1蛋白表达无明显影响,而转染miR-23a inhibitor至SW480细胞后ESRP1蛋白表达水平明显升高。结论 miR-23a在直肠癌组织和细胞系中的表达均显著升高,miR-23a可通过下游靶基因ESRP1从而调控直肠癌细胞增殖和凋亡。     

miR-584对人胶质母细胞瘤侵袭和迁移能力的影响

目的探讨miR-584对人胶质母细胞瘤U251细胞侵袭和迁移能力的影响。方法将化学合成的miR-584-3p在脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人胶质母细胞瘤U251,细胞分为空白对照组(无转染,其他条件相同)、mimics NC组(转染miR-584-3p mimics阴性对照序列)、miR-584-3p mimics组(转染miR-584-3p mimics)、inhibitor NC组(转染miR-584-3p inhibitor阴性对照序列)和miR-584-3p inhibitor组(转染miR-584-3p inhibitor)。Real-time PCR法检测细胞中miR-584-3p的表达水平;CCK-8法检测细胞增殖能力;划痕实验和Transw ell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果与空白对照组和mimics NC组相比,miR-584-3p mimics组的miR-584-3p表达上调约100倍(P<0.05),细胞增殖能力无明显差异(P>0.05),细胞侵袭和迁移能力明显下降(P<0.05);与空白对照组和inhibitor NC组相比,miR-584-3p inhibitor组的miR-584-3p表达下调至空白对照组的5%(P<0.05),细胞增殖能力无明显差异(P>0.05),细胞侵袭和迁移能力显著增强(P<0.05)。结论 miR-584-3p mimics转染抑制了U251细胞的侵袭和迁移能力;miR-584-3p inhibitor转染能增强U251细胞的侵袭和迁移能力。     

miR-129-5p靶向HMGB1对胰腺癌细胞凋亡的作用研究

目的：研究miR-129-5p调控HMGB1表达在胰腺癌细胞凋亡中的作用。方法：以未处理的胰腺癌SW1990细胞作为对照组（Control组），用脂质体转染法将mimics-NC（空载体）、miR-129-5p mimics、inhibitor-NC（空载体）、miR-129-5p inhibitor分别转染SW1990细胞作为mimics-NC组、miR-129-5p过表达组（miR-129-5p mimics组）、inhibitor-NC组、miR-129-5p低表达组（miR-129-5p inhibitor组），通过在线靶基因预测网站Target genes预测miR-129-5p与HMGB1是否存在结合位点，双荧光素酶基因报告实验验证miR-129-5p与HMGB1的靶向关系。采用qRT-PCR检测各组细胞中miR-129-5p的表达水平，Western blot法检测HMGB1蛋白及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2表达。Hoechst染色观察细胞凋亡变化。结果：与mimics-NC组及Control组比较，miR-129-5p mimics转染显著上调miR-12...     

MicroRNA-124对喉鳞状细胞癌细胞自噬、侵袭和迁移的影响

目的探讨microRNA-124(miR-124)在人喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中的表达及其对LSCC细胞自噬、侵袭和迁移的影响。方法选取2016年1月至2018年9月新乡医学院第一附属医院手术切除的LSCC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)标本各12例,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LSCC组织和癌旁组织中miR-124表达;体外培养人Hep-2细胞,将其分为miR-124类似物(miR-124 mimics)组、miR-124抑制剂(miR-124inhibitor)组、类似物阴性对照(mimics NC)组、抑制剂阴性对照(inhibitor NC)组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,进行细胞转染;采用qRT-PCR检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组细胞中miR-124的表达水平,Western blot法检测LSCC组织、癌旁组织和mimics NC组、miR-124 mimics组、inhibitor NC组、miR-124 inhibitor组细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ的表达,Transwell小室法检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的迁移能力。结果 LSCC组织中miR-124相对表达量显著低于癌旁组织(P <0. 05)。LSCC组织中LC3B-Ⅱ蛋白表达显著高于癌旁组织(P <0. 05)。miR-124 mimics组细胞中miR-124相对表达量显著高于mimics NC组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组细胞中miR-124相对表达量显著低于inhibitor NC组(P <0. 05)。miR-124 mimics组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著低于mimics NC组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著高于inhibitor NC组(P <0. 05)。miR-124 mimics组侵袭细胞数显著少于mimics NC组和mimics+西罗莫司组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组侵袭细胞数显著多于inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组(P <0. 05)。划痕培养72 h后,inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组细胞的划痕愈合率低于miR-124 inhibitor组(P <0. 05);培养96 h后,mimics NC组和mimics+西罗莫司组细胞的划痕愈合率高于miR-124 mimics组(P <0. 05)。结论人LSCC组织中miR-124表达显著下调,人LSCC组织和miR-124过表达细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达显著上调,miR-124可能通过抑制自噬而抑制LSCC细胞的侵袭和迁移能力。     

miR-126对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡、周期及SOX2表达的影响

目的探讨miR-126通过靶向调控SOX2表达影响结肠癌细胞的增殖和凋亡。方法脂质体Lipofectamine~(TM)2000将miR-126 mimics和miR-126 NC转入SW480细胞中,RT-PCR法检测miR-126表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,RT-PCR法及western blot检测细胞中SOX2蛋白及mRNA表达,并进行荧光素酶报告基因分析。结果与miR-126 NC组比较,miR-126 mimics组miR-126表达量显著提高(P0.01),细胞活力降低(P0.01),细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著提高(P0.01),细胞周期阻滞于G1期(P0.01),同时miR-126 mimics能够靶向下调SOX2蛋白及mRNA表达(P0.01)。结论 miR-126 mimics通过靶向下调SOX2表达进而抑制SW480细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

miR-26a靶向HMGA1基因对结肠癌细胞生长、侵袭和迁移的影响

目的：探讨miR-26a靶向高迁移率族蛋白1（HMGA1）基因对结肠癌细胞生长、侵袭和迁移的影响,阐明HMGA1基因是否为miR-26a的靶基因。方法：将miR-NC （对照）、miR-26a mimics （模拟物）和miR-26a inhibitor （抑制物）转染人结肠癌SW480细胞作为miR-NC组、miR-26a mimics组和miR-26a inhibitor组。RT-PCR和Western blotting法分别检测各组SW480细胞中HMGA1 mRNA和蛋白表达水平。采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组SW480细胞中双荧光素酶活性,以此确定HMGA1是否为miR-26a的靶基因。采用CCK8实验检测各组细胞增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞侵袭数和迁移数。结果：HMGA1基因是miR-26a的靶基因。与miR-NC组比较,转染24、48和72 h时miR-26a mimics组SW480细胞增殖活力明显降低（P<0.01）,而miR-26a inhibitor组细胞增殖活力明显升高（P<0.01）。与miR-NC组比较,各时间点miR-26a mimics组和miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均降低（P<0.01）,而miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均升高（P<0.01）;与miR-26a mimics组比较,各时间点miR-26a mimics+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均升高（P<0.01）;与miR-NC+pcDNA3.1-HMGA1组比较,各时间点miR-26a+pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖活力、细胞侵袭数和细胞迁移数均降低（P<0.01）。结论：HMGA1是miR-26a的靶基因。上调miR-26a表达可抑制人结肠癌SW480细胞增殖,下调miR-26a表达可促进人结肠癌SW480细胞增殖。     

基于lncRNA DGCR5介导miR-1180/SFRP1/Wnt通路对结直肠癌细胞生长转移的影响

目的 分析长链编码RNA (lncRNA) DiGeorge综合征临界区基因5 (DGCR5)对结直肠癌细胞生长转移的影响,并基于miR-1180/分泌型卷曲相关蛋白1 (SFRP1)/Wnt通路分析其中的机制。方法 选取人结直肠癌细胞系SW480进行培养。将SW480细胞分为对照组（C组,正常培养SW480细胞）、DGCR5 NC组（SW480细胞+转染DGCR5 NC载体）、DGCR5 mimic组（SW480细胞+转染DGCR5 mimic载体）以及DGCR5 inhibitor组（SW480细胞+转染DGCR5inhibitor载体）。转染完成后采用qPCR检测各组细胞中DGCR5的表达,验证细胞是否转染成功;分别采用CCK8法、克隆形成实验、平板划痕实验以及Transwell实验检测细胞活力、增值、迁移以及侵袭情况。荧光素酶报告测定lncRNA DGCR5与miR-1180的靶向关系;qPCR检测转染后各组细胞miR-1180/SFRP1的表达;WB检测各组细胞SFRP1、Wnt和β-catenin蛋白表达水平。结果 与DGCR5 NC组比较,DGCR5 inhibitor组...     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.