同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制及其对血管平滑肌细胞的影响

高同型半胱胺酸血症，是动脉粥样硬化的一个独立危险因素。它通过引起氧化应激、蛋白质化或细胞内的低甲基化反应，导致血管内皮细胞功能障碍，刺激平滑肌细胞（SMC）增生，促进血小板活化。同型半胱氨酸对SMC除具有促有丝分裂原样作用外，还可以促进其合成和分泌胶原蛋白等细胞外基质以及丝氨酸蛋白酶、单核细胞趋化蛋白－1，从而破坏血管壁的正常结构，趋化炎性细胞的迁移，所有这些都促进了动脉粥样硬化的发生。     

替米沙坦对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1、核因子κB表达及细胞黏附的影响

目的观察替米沙坦对同型半胱氨酸诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、核因子κB(NF-κB)表达及与单核细胞黏附的影响。方法胶原酶消化法获取人脐静脉内皮细胞;RT-PCR检测VCAM-1 mRMA的表达;Western blot检测VCAM-1、NF-κB蛋白的表达;ROSE BENGAL染色法检测单核细胞-血管内皮细胞黏附功能。结果与空白对照组相比,同型半胱氨酸增强了人脐静脉内皮细胞VCAM-1 mRMA、VCAM-1蛋白、NF-κB p65蛋白的表达水平及与单核细胞黏附能力。替米沙坦(1000 nmol/L组)明显降低了同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1 mRMA、VCAM-1蛋白、NF-κB p65蛋白及与单核细胞的黏附水平(P<0.01)。与同型半胱氨酸组比,PDTC(NF-κB抑制剂)组NF-κB p65蛋白、VCAM-1 mRMA、VCAM-1蛋白表达水平均明显降低,内皮细胞与单核细胞的黏附水平也明显降低(P<0.01)。结论替米沙坦抑制了VCAM-1 mRMA和蛋白的表达及内皮与单核细胞的黏附水平,其机制可能是通过抑制NF-κB而抑制炎症反应及内皮损伤。     

葛根素对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞的增殖及蛋白激酶-α和核转录因子-κB表达的影响

目的:观察葛根素对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及对蛋白激酶-α(PKC-α)和核转录因子(NF)-κB表达的影响,探讨其可能存在的抑制VSMC增殖的分子机制.方法:体外培养Wistar大鼠的VSMC,给予单纯1.5×10-3mol/L葛根素处理2 h(P组)、单纯10-8mol/L AngⅡ处理24 h(A组)和1.5×10-3mol/L葛根素预处理2 h后再加10-8mol/L AngⅡ处理24 h(P A组)刺激后,四氮唑盐法检测增殖情况,采用Western blot的方法检测PKC-α和NF-κB的表达.结果:对照组、P组、A组、P A组VSMC增殖的A值分别为0.178±0.017、0.198±0.028、0.373±0.017和0.286±0.024.与对照组比较,A组和P A组差异有统计学意义(均P＜0.05);A组和P A组VSMC中PKC-α、NF-κB的表达与对照组比较,均显著增高(均P＜0.05);P A组较A组均有明显下降(均P＜0.05).结论:一定浓度的葛根素可通过下调PKC-α和NF-κB的表达来抑制AngⅡ引起的VSMC的增殖.     

依帕司他对醛糖还原酶和核转录因子-κB表达及血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究依帕司他对醛糖还原酶(AR)、核转录因子(NF)-κB表达及血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,探讨依帕司他抗细胞增殖的可能机制。方法取大鼠胸主动脉段行VSMC培养,用高浓度葡萄糖(22.5mmol/L)诱导AR基因表达,然后加入不同浓度的依帕司他,培养3d后行VSMC计数,并用免疫组化、RT-PCR及原位杂交的方法检测NF-κB及AR的表达。结果①随依帕司他浓度的增加,VSMC计数逐渐减少。②高浓度葡萄糖时NF-κB表达强阳性,加入不同浓度的依帕司他后,NF-κB表达逐渐减弱。③高浓度葡萄糖可明显诱导AR基因表达,依帕司他对其表达有抑制作用,且呈剂量依赖性。结论①高浓度葡萄糖可促进VSMC增殖,依帕司他可抑制这一增殖作用,且具有剂量依赖性。②依帕司他可抑制AR及NF-κB的表达。③依帕司他可能是通过抑制AR及NF-κB的表达继而抑制VSMC的增殖。     

白细胞介素-6对兔血管平滑肌细胞产生C反应蛋白的影响

目的:探讨白细胞介素-6(IL-6)能否诱导体外原代培养的兔血管平滑肌细胞(VSMCs)产生C反应蛋白(CRP)。方法:体外原代培养新西兰兔腹主动脉VSMCs。分别用白细胞介素(IL)-6(10 ng/ml)、IL-1β25 ng/ml或IL-6(10 ng/ml)+IL-1β(25 ng/ml)刺激VSMCs 48 h。对照组用等体积的IL-6的溶剂孵育48 h。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别检测培养细胞CRP mRNA和蛋白的表达情况。结果:对照组的原代VSMCs未见CRP的产生。VSMCs与IL-6单独孵育48 h后,CRP mRNA的表达量是对照组的(3.50±1.17)倍,能产生少量CRP,与对照组相比有差异。单独应用IL-1β不能诱导VSMCs产生CRP,但是在IL-1β和IL-6的联合刺激下,CRP mRNA表达量是对照组的(5.92±1.30)倍,CRP的合成亦达最大值。结论:IL-6能诱导原代培养的兔VSMCs产生CRP。尽管单独应用IL-1β不能刺激VSMCs产生CRP,但是它却能显著增强IL-6诱导CRP的表达。     

核因子-κB活化机制及其对粥样斑块细胞的作用

核因子－κB是调节细胞基因转录的关键因子之一,它参与了许多与炎症反应有关的基因的表达调控。动脉粥样是硬化是一种炎症性疾病,核因子－κB存在于参与病变发展的多种细胞内,与病变的发生和发展有关,本文就核因子－κB的概况及在动脉粥样硬化病变发生和发展中的作用做一综述。     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞的氧化应激损伤和白细胞介素-8分泌的影响

同型半胱氨酸(Hcy)是近年来确认动脉粥样硬化的一项独立的新的危险因素.本实验模拟在高浓度Hcy的环境下,观察血管内皮细胞氧化应激毒性损伤相关指标,并了解白细胞介素-8的分泌情况,进一步探讨Hcy致动脉粥样硬化的可能机制.     

球囊损伤兔主动脉后核因子-κB活性的动态变化

为探讨经皮球囊损伤兔主动脉内膜后血管组织中核因子－κB活性的动态变化,选日本大白兔18只,经股动脉插入4F Fograrty导管至主动脉,充盈球囊,回拖球囊至髂总动脉,反复3次,复制球囊损伤主动脉内膜的动物模型。于损伤后0、12、24、48和72h处死动物,提取腹主动脉壁组织胞核蛋白,电泳流动漂移技术检测因子－κB活性的动态变化。结果表明,正常主动脉组织中无明显的核因子－κB激活现象,球囊损伤主动脉内膜后即刻在血管组织有一定水平的核因子－κB激活,12h达高峰,持续48h,72h逐渐恢复到对照水平。密度扫描结果提示,核因子－κB活性于球囊损伤内膜后12h时较对照（内膜损伤后即刻）增高3．7倍,24h增加1．4倍,72h逐渐恢复到对照水平。提示球囊损伤兔主动脉内膜后血管组织中核因子－κB活性异常激活,可能是血管平滑肌细胞增殖的启动机制之一。     

同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞的增殖作用

目的 :探讨同型半胱氨酸 (Hcy)对血管平滑肌细胞 (VSMC)生长的影响。方法 :采用MTT法检测细胞数量及流式细胞术测定细胞周期。结果 :5× 10 -4mol/LHcy干预处于生长静止期的细胞 4 8、72h细胞数量较对照组明显增加 (P <0 .0 1) ,分别增加了 5 0 .75 %和 84 .83%。当采用 1× 10 -4,2 .5× 10 -4,5× 10 -4,1× 10 -3mol/L的Hcy干预细胞 72h后 ,其细胞数量分别较对照组增加了4 1.5 6 % ,5 8.4 4 % ,6 6 .2 3% ,74 .0 2 %。并且当 5× 10 -4mol/LHcy干预细胞 2 4、36、4 8h后 ,其S期、G2 /M期在细胞周期的比例也明显增加 (P <0 .0 1)。结论 :Hcy能明显诱导VSMC增殖 ,并呈现时间和剂量依赖关系 ,提示Hcy通过诱导VSMC的增殖可导致动脉粥样硬化的发生。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的探讨同型半胱氨酸（Hcy）对体外培养的人血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的影响。方法采用组织贴块法体外培养人VSMC,给予Hcy干预。5个不同浓度组Hcy分别为0、100、200、500、1000μmol/L,培养24 h,每个浓度设6个标本;同一浓度（1000μmol/L）分别培养0、6、12、24、48 h,每个时间设6个标本;然后用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果单因素方差分析显示,5个不同浓度和时间的细胞凋亡率之间存在统计学差异（P〈0.01）;凋亡率与Hcy干预浓度（0-1000μmol/L）和干预时间（0-48 h）存在直线相关关系（r分别为0.998、0.999,P〈0.01）。结论Hcy可以诱导人VSMC的凋亡,而且这一效应呈浓度和时间依赖性。     

蛋白激酶C-核因子κB信号转导通道对人肺动脉平滑肌细胞增殖和血管内皮生长因子表达的影响

目的　探讨蛋白激酶C(PKC) 核因子κB(NF κB)信号转导通道对人肺动脉平滑肌细胞 (HPASMCs)增殖和血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。方法　体外培养HPASMCs ,用工具药PKC激活剂 12 肉豆蔻酰 13 乙酸佛波酯 (PMA)和NF κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷 (PDTC) ,将HPASMCs分为对照组、PMA组和PMA PDTC组在常氧和缺氧条件下培养。逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测VEGFmRNA表达 ,Westernblot法检测VEGF和NF κB的抑制蛋白IκBα蛋白表达 ,免疫细胞化学法检测NF κBp6 5的表达和定位 ,流式细胞术检测细胞周期时相分布。结果　( 1)NF κBp6 5胞核染色阳性率、IκBα蛋白相对表达量及细胞周期G2 /M % :常氧或缺氧PMA组与相应对照组、PMA PDTC组比较差异均有显著性 (P均 <0 0 5 ) ;缺氧PMA组与常氧PMA组比较差异有显著性 (P <0 0 5 )。 ( 2 )VEGFmRNA和蛋白表达 :常氧对照组、PMA组、PMA PDTC组组间差异均无显著性 (P均 >0 0 5 ) ;缺氧PMA组均高于缺氧对照组、缺氧PMA PDTC组、常氧PMA组 ,差异均有显著性 (P均 <0 0 5 )。 ( 3)缺氧PMA组NF κB胞核染色阳性率、VEGF蛋白相对表达量、G2 /M %之间均呈正相关 (r =0 5 87～ 0 710 ,P均 <0 0 5 )。结论　常氧培养HPASMCs存在PKC NF κB信号转导通道 ;     

Fk-appaB在动脉粥样硬化中的作用

目的　研究体内基因多显性转录核因子 (NF kappaB)在动脉粥样硬化疾病中病变的动脉内皮细胞中表达的情况及意义。方法　采用免疫组织化学染色S P法检测 30例动脉粥样硬化病变动脉血管和 30例正常成年人动脉血管内皮细胞的NF kappaBP6 5蛋白 ,细胞间粘附分子 1(ICAM 1)和血管内皮细胞粘附分子 1(VCAM 1)的表达水平。结果　 (1)与正常动脉血管内皮细胞相比较 ,动脉粥样硬化病变动脉血管内皮细胞NF kappaBP6 5蛋白 ,ICAM 1以及VCAM 1表达水平均呈显著性增强 (P<0 0 0 1)。 (2 ) 6 0例动脉血管内皮细胞检测数据提示NF kappaB蛋白表达和ICAM 1表达呈直线回归关系 (b =0 80 2 ,P <0 0 0 1) ;NF kappaBP6 5蛋白表达和VCAM 1表达也呈直线回归关系 (b =0 711,P<0 0 0 1)。结论　NF kappaB的激活导致动脉粥样硬化患者体内ICAM 1和VCAM 1表达增强 ,加速了动脉粥样硬化病变过程     

Induction of interleukin-6 expression by angiotensin II in rat vascular smooth muscle cells.

Recent studies suggest that atherosclerosis is a kind of inflammatory process and that cytokine plays important roles in this process. Although it is generally accepted that angiotensin II (Ang II) plays an important role in atherogenesis, the role of Ang II in cytokine production has not been explored. In this report, we investigated the effect of Ang II on the production of interleukin-6 (IL-6), which is a multifunctional proinflammatory cytokine in rat vascular smooth muscle cells. Ang II significantly increased the expression of IL-6 mRNA and protein in a dose-dependent manner (10(-10) to 10(-6) mol/L). The expression of IL-6 mRNA induced by Ang II showed 2 peaks at 30 minutes and 12 to 24 hours after stimulation. The effect of Ang II on IL-6 release and mRNA expression was completely blocked by an Ang II type 1 receptor antagonist, CV11974; however, an Ang II type 2 receptor antagonist, PD123319, showed no effect. Chelating of intracellular Ca(2+) with BAPTA-AM, inhibition of tyrosine kinase with genistein, and inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase with PD98059 completely abolished the effect of Ang II. However, downregulation of protein kinase C by pretreatment with a phorbol ester for 24 hours or a specific protein kinase C inhibitor, calphostin C, did not affect the Ang II-induced expression of IL-6 mRNA. Deletion and mutational analysis of IL-6 gene promoter showed that cAMP-responsive element was important for Ang II-induced IL-6 gene expression. Gel mobility shift assay showed an increase of cAMP-responsive element binding protein by Ang II. These results provide new insights into Ang II signaling and the role of Ang II in the progression of inflammatory changes of blood vessels.     

瑞舒伐他汀对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶2表达和细胞迁移的影响

目的 观察瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸(Hcy)诱导大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶2(MMP 2)表达以及对血管平滑肌迁移的影响,探讨Hcy致动脉粥样硬化以及他汀药物逆转的可能机制.方法 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,加入不同浓度的Hcy分别作用 24 h、48 h和72 h,在1000 μmol/L Hcy浓度下分别加入不同浓度的瑞舒伐他汀干预,采用免疫印迹法和明胶酶谱法检测细胞培养上清液中MMP 2的表达及酶的活性.在Transwell小室外室中加入1000 μmol/L浓度的Hcy,内室加入定量的大鼠平滑肌细胞悬液,培养48 h,观察Hcy对平滑肌细胞迁移侵袭力的影响;同时加入不同浓度瑞舒伐他汀溶液,分别培养24 h、48 h和72 h,观察瑞舒伐他汀对Hcy诱导平滑肌细胞迁移侵袭力的影响.结果 Hcy浓度在50～5000 μmol/L时促进血管平滑肌细胞MMP 2蛋白的表达,Hcy浓度在50～1000 μmol/L时增强血管平滑肌细胞MMP 2的酶活性,浓度在5000 μmol/L时抑制MMP 2的活性(F值分别为9.31、6.44、5.97,均P＜0.05);瑞舒伐他汀浓度在10-9～10-5 mol/L时,能抑制Hcy对血管平滑肌MMP 2表达和酶活性的增强作用(F值分别为3.92、4.78、2.14,均P＜0.05).Hcy在50～5000 μmol/L浓度下能刺激血管平滑肌细胞迁移,Hcy浓度为0、50、100、500、1000、5000 μmol/L时平滑肌细胞迁移分别为(18.32±2.17)个、(32.68±4.34)个、(44.75±4.08)个、(61.39±5.21)个、(79.74±5.54)个 和(90.78±5.83)个(F=5.31,P＜0.05);而瑞舒伐他汀可以抑制Hcy对血管平滑肌细胞迁移的刺激作用,在瑞舒伐他汀浓度为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L时平滑肌细胞迁移分别为(79.74±5.54)个、(62.53±6.41)个、(48.37±5.66)个、(31.41±4.79)个、(19.27±3.62)个和(11.17±2.33)个(F=4.99,P＜0.05).结论 Hcy能影响血管平滑肌细胞MMP 2蛋白的表达,瑞舒伐他汀能抑制Hcy对血管平滑肌细胞MMP 2的表达和酶活性的增强作用,并能抑制Hcy对血管平滑肌细胞迁移的刺激作用,这可能是瑞舒伐他汀抗动脉粥样硬化的作用机制之一.

Abstract：

Objective To observe the effects of rosuvastatin on the homocysteine (Hcy)-induced expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP 2) and cell migration in rat vascular smooth muscle cells (VSMCs), and to explore the possible mechanism of Hcy-induced atherosclerosis and the role of statins in reversing atherosclerosis. Methods In one cell culture plate, the cultured rat VSMCs were incubated with different concentrations of Hcy (0, 50, 100, 500, 1000 μmol/L and 5000 μmol/L) in vitro for 24 h, 48 h and 72 h. And in another cell culture plate, the different concentrations of rosuvastatin (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 mol/L and 0 mol/L) were added to the cultured rat VSMCs (while the concentration of Hcy was 1000 μmol/L). The MMP 2 expression and enzyme activity were determined by gelatin zymography and Western blotting. The effects of Hcy and rosuvastatin on cell migration and invasiveness of VSMCs were observed. Results Hcy (50-5000 μmol/L) increased the protein expression, and Hcy (50-1000 μmol/L) increased enzyme activity of MMP 2 significantly. But Hcy (5000 μmol/L) inhibited activity of MMP 2 (F=9.31, 6.44 and 5.97, all P＜0.05). Rosuvastatin (10-9-10-5 mol/L) inhibited Hcy-induced expression and enzyme activity increasing of MMP 2. The counts of cell migration of VSMCs were 18.32±2.17, 32.68±4.34, 44.75±4.08, 61.39±5.21, 79.74±5.54 and 90.78±5.83, while the concentration of Hcy was 0, 50, 100, 500, 1000 μmol/L and 5000 μmol/L respectively (F=5.31, P＜0.05). The counts of cell migration of VSMCs were 79.74±5.54, 62.53±6.41, 48.37±5.66, 31.41±4.79, 19.27±3.62 and 11.17±2.33, while the concentration of rosuvastatin was 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 and 10-5 mol/L respectively (F=4.99, P＜0.05). Rosuvastatin could decrease the stimulation of Hcy-induced migration of VSMCs. Conclusions Hcy can influence the MMP 2 protein expression/activity in VSMCs, and rosuvastatin can inhibit augmentation of Hcy-induced MMP 2 expression/activity and migration of VSMCs. It may be one of the multiple-effects of rosuvastatin reducing atherosclerosis.     

膜联蛋白A5抑制同型半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞组织因子的表达和活化

目的 研究膜联蛋白A5(Annexin A5)对同型半胱氨酸(Hcy)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)组织因子表达和活化的抑制作用.方法 采用组织贴块法培养人脐动脉VSMC,应用α-肌动蛋白(actin)免疫组化法鉴定细胞.将不同浓度(10、100、500、1000 μmol/L)的Hcy与VSMC孵育,在用Annexin A5(50 μg/ml)或组织因子的单抗(10 μg/ml)干预的条件下,流式细胞技术(FCM)检测VSMC的组织因子细胞膜表达,FX生成反应检测VSMC细胞培养液组织因子活性,Western blot检测VSMC的组织因子表达.结果 用PBS作为对照的VSMC细胞膜表面有低水平的TF表达,阳性率为(4.01±2.11)%.Hcy作用4 h后,100 μmol/L即可诱导VSMC TF蛋白表达升高,阳性率为(14.01±3.72)%,1000 μmol/L时达高峰,阳性率为(37.67±4.96)%.与PBS对照组细胞相比,Hcy能显著诱导细胞TF的表达.用100 μmol/L的Hcy作用VSMC,加入Annexin A5或TF的单抗后,在4、8、16 h均能有效抑制TF的细胞膜表达和培养液中TF活性.不同浓度的Annexin A5能显著抑制Hcy诱导的VSMC TF蛋白的表达.结论 Annexin A5能抑制Hcy诱导的VSMC组织因子的表达和活化,对此作用过程的深入研究,可能为防治冠状动脉粥样斑块血栓的形成和发展提供新的契机.     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞E-选择素、IL-6分泌的影响

目的探讨同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）对人脐静脉内皮细胞E-选择素、白细胞介素6（IL6）分泌的影响。方法在人脐静脉内皮细胞ECV304培养基中加入不同浓度Hcy,孵育不同时间,用ELISA法分别测定培养上清液中E-选择素及IL6的含量。结果终浓度为250μmol/L的Hcy孵育内皮细胞,E选择素的分泌在4h显著上调,6h达峰值;IL6的分泌在6h开始升高,24h达峰值,之后随着时间的延长逐渐下降。Hcy呈浓度依赖性（50μmol/L～500μmol/L）促进内皮细胞E选择素及IL6的分泌。结论Hcy能刺激血管内皮细胞分泌E选择素及IL6。     

白细胞介素-10在川崎病炎性细胞因子介导的血管损伤中的作用初探

目的　探讨白细胞介素 10 (IL 10 )在炎性细胞因子介导的川崎病血管内皮损伤中的作用及机制。方法　建立人脐静脉内皮细胞培养模型 ,ELISA双抗体夹心法检测川崎病患儿外周血单个核细胞 (PBMC)活化后培养上清IL 6、IL 1β、肿瘤坏死因子 α(TNF α)、IL 10的分泌量 ;AnnexinV/PI双染色法 ,流式细胞仪检测川崎病患儿PBMC培养上清所诱导的内皮细胞凋亡率 ;凝胶电泳迁移率转换实验 (EMSA)检测所活化PBMC核因子NF κB活性。结果　川崎病组患者PBMC体外刺激活化后IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子及IL 10的分泌量均明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ,其培养上清所诱导内皮细胞凋亡率 (38 4± 7 8) %较正常组 (2 8± 0 8) %明显升高。抗IL 6、TNF αMcAb、IL 1ra加入川崎病患儿PBMC培养上清 ,可不同程度抑制川崎病患儿PBMC培养上清所诱导内皮细胞的凋亡 ,而抗IL 10McAb加入川崎病患儿PBMC培养上清所诱导内皮细胞的凋亡细胞反而增多 ,凋亡细胞的百分率高达 (5 8 6± 14 6 ) %。川崎病患儿PBMC刺激活化后核因子NF κB活性显著增高。于PBMC培养上清加入IL 10 ,可见伴随着IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子在PBMC中的表达降低 ,NF κB活性也降低 ,同时内皮细胞凋亡明显减少。结论　IL 10抑制川崎病患儿免疫