Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的:扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法:以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果:成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论:Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

Survivin启动子与肿瘤

利用特异性启动子介导的基因治疗是肿瘤靶向性治疗的一种有效途径.Survivin启动子既有肿瘤细胞的靶向性,又有增殖性血管内皮细胞的靶向性,且能有效介导目的基因表达,展示了其在肿瘤靶向性治疗研究中的良好前景.     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

细胞周期特异性Survivin启动子在胶质瘤细胞T98G中活性的初步研究

目的　研究在细胞周期G2 /M期特异性的Survivin基因启动子在多型性胶质母细胞瘤 (glioblastomamultiform ,以下简称胶质瘤 )细胞株T98G中的活性 ,为该启动子在胶质瘤靶向性基因治疗中的应用提供依据。方法　用RT PCR法检测Survivin基因在胶质瘤细胞株T98G及正常肝中的表达 ,用转染荧光素酶报告基因的方法 ,比较不同长度的Survivin基因启动子在非同步化和阻断于G1期细胞中的活性。结果　Survivin基因在T98G胶质瘤细胞中表达 ,而在正常肝细胞中不表达。Survivin基因启动子在非同步化细胞中的活性大约是G1期细胞中的 11倍。结论　Survivin启动子在转录水平上可以选择性地使报告基因在胶质瘤细胞中表达 ,这使它成为一个在胶质瘤基因治疗中有潜力的启动子。     

Survivin基因及其在肿瘤研究中的意义

Survivin基因是一种新的凋亡抑制基因，在肿瘤形成过程中与细胞凋亡的抑制和细胞增生有关，早期出现于肿瘤组织细胞中，并成为某些肿瘤预后不良的标志。在体内和体外研究中，针对Survivin的反义核体酸及其突变体可以诱导细胞凋亡，降低肿瘤生产的能力，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此该基因有可能成为肿瘤诊断和治疗的新的靶位。     

环氧化酶2启动子调控促凋亡基因BAX在卵巢癌细胞系的特异性高表达

目的:验证环氧化酶-2(COX-2)启动子能调控下游基因特异性在COX-2阳性的卵巢癌细胞系高表达;并以CMV启动子为对照,分析COX-2启动子的转录效率.方法:构建重组质粒COX-2-BAX和CMV-Luc.脂质体介导分别把质粒phPES2,CMV-Luc瞬时转染COX-2阳性的卵巢癌细胞系SKOV-3和COX-2阴性的结肠癌细胞系SW480,检测荧光素酶报告基因的表达情况.同法把质粒COX-2-BAX、pcDNA3-BAX转染SKOV-3和SW480,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:成功构建重组质粒COX-2-BAX和CMV-Luc.COX-2-Luc转染SKOV3和SW480细胞24 h后报告基因活性分别为1554±86.5和53.7±10.9.CMV-Luc财法转染后,报告基因活性分别为9851.7±129.5和8831.0±167.3.COX-2-BAX转染SKOV-3和SW480细胞36 h后细胞凋亡率分别为10.4%,3.7%;CMV-BAX同法转染后,细胞凋亡率分别为21.7%,25.6%.结论:COX-2启动子可调控下游基因特异性地在COX-2阳性的卵巢癌细胞系中高表达,但转录效率明显低于CMV启动子.含COX-2启动子经合理修饰后可用于卵巢癌的基因治疗.     

L-plastin启动子调控下的肿瘤细胞特异性表达载体的构建及活性分析

目的：构建肿瘤细胞特异性表达载体pcDNA3.1PLN-GFP及鉴定活性。方法：用2.4kb的L-plastin启动子,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告蛋白,通过分子克隆技术,构建真核表达载体pcDNA3.1PLN-GFP,用脂质体介导法转染肿瘤细胞和成纤维细胞后,流式细胞术（FACS）分析载体的肿瘤细胞特异性和活性。结果：仅在表达内源性L-plastin的肿瘤细胞和转化的293细胞中有GFP的表达,发光细胞比率较高,而且L-plastin启动子的活性与CMV启动子活性相当,而在其它细胞中没有检测到GFP的表达。结论：我们构建的pcDNA3.1PLN-GFP是一肿瘤特异性的高效表达载体。     

Survivin基因及其在肿瘤研究中的意义

Survivin基因是一种新的凋亡抑制基因，在肿瘤形成过程中与细胞凋亡的抑制和细胞增生有关，早期出现于肿瘤组织细胞中，并成为某些肿瘤预后不良的标志。在体内和体外研究中，针对Survivin的反义核酸及其突变体可以诱导细胞凋亡，降低肿瘤生长的能力，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此该基因有可能成为肿瘤诊断和治疗的新的靶位。     

survivin基因启动子调控的HSV-tk真核表达载体的构建及在人喉癌细胞中的特异性表达

目的构建survivin基因启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶(humansimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)真核表达载体,检测其在人喉癌细胞中的表达。方法PCR克隆survivin基因启动子与tk基因,双酶切后分别插入pCI-neo真核表达载体中,酶切鉴定后用脂质体法转染喉癌细胞(Hep-2)和正常细胞(7702),RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况。结果成功构建了survivin启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/survivin-tk;并通过RT-PCR检测出survivin启动子调控的表达载体在喉癌细胞中有表达,而在正常细胞中无明显表达。结论survivin启动子具有肿瘤特异性,有可能解决喉癌基因治疗中的特异性杀伤问题。     

组织特异性启动子及其在肿瘤基因治疗中的应用

随着基因治疗研究的深入，愈来愈多的组织特异性启动子已被用于调控目的基因在靶器官中的表达，尤其是携带治疗性基因可以实现对肿瘤组织的特异性杀伤作用，组织特异性启动子的应用已成为基因治疗中的一个重要手段，现综述各系统启动子的分类及其应用。     

Survivin靶向microRNA表达载体的构建和鉴定

目的：设计并构建Survivin靶向的microRNA表达载体，观察其对Survivin基因的抑制作用。方法：以Survivin为靶基因，根据pPRIME载体要求，设计针对Survivin的microRNA序列，PCR扩增获得目的片段并克隆到载体中，序列正确的载体脂质体转染Hela细胞，RT—PCR和Western blotting检测其对Survivin的抑制作用。结果：用Xho I和EcoR I双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确，后者在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制Hela细胞中Survivin的表达。结论：Survivin靶向microRNA表达载体构建成功，并能抑制靶基因的表达，为其在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

Targeting of tumor radioiodine therapy by expression of the sodium iodide symporter under control of the survivin promoter

To test the feasibility of using the survivin promoter to induce specific expression of sodium/iodide symporter (NIS) in cancer cell lines and tumors for targeted use of radionuclide therapy, a recombinant adenovirus, Ad-SUR-NIS, that expressed the NIS gene under control of the survivin promoter was constructed. Ad-SUR-NIS mediating iodide uptake and cytotoxicity was performed in vitro. Scintigraphic, biodistribution and radioiodine therapy studies were performed in vivo. PC-3 (prostate); HepG2 (hepatoma) and A375 (melanoma) cancer cells all exhibited perchlorate-sensitive iodide uptake after infection with Ad-SUR-NIS, approximately 50 times higher than that of negative control Ad-CMV-GFP-infected cells. No significant iodide uptake was observed in normal human dental pulp fibroblast (DPF) cells after infection with Ad-SUR-NIS. Clonogenic assays demonstrated that Ad-SUR-NIS-infected cancer cells were selectively killed by exposure to (131)I. Ad-SUR-NIS-infected tumors show significant radioiodine accumulation (13.3 ± 2.85% ID per g at 2 h post-injection), and the effective half-life was 3.1 h. Moreover, infection with Ad-SUR-NIS in combination with (131)I suppressed tumor growth. These results indicate that expression of NIS under control of the survivin promoter can likely be used to achieve cancer-specific expression of NIS in many types of cancers. In combination with radioiodine therapy, this strategy is a possible method of cancer gene therapy.     

Silencing stathmin gene expression by survivin promoter-driven siRNA vector to reverse malignant phenotype of tumor cells

Stathmin gene overexpression has been shown to play an important role in maintenance of malignant phenotype in tumor cells, and the blocking efficacy and tumor specificity of this target has been concerned in clinical trails. In this report, we designed survivin promoter-driven siRNA eukaryotic expression vector that expressed the small interfering RNA targeting stathmin gene to selectively knock down the stathmin gene expression in two different kinds of tumor cell lines while sparing normal cell lines. The therapeutic potential of this recombinant vector was tested in human cervical cancer Hela cells and osteosarcoma SSOP-9607 cells, and in human umbilical vein endothelial cell line ECV304 cells as control. The siRNA vector- transfected Hela cells and SSOP-9607 cells revealed marked inhibition of stathmin expression and a dramatic growth inhibition comparing with ECV304 cells, parental-vector transfected cells and untransfected cells. Cell cycle analysis of siRNA vector transfected tumor cells by Flow Cytometry showed G(2)/M phase block, while morphologic analysis by TURNEL staining method showed marked increase of apoptosis. Our study indicates that survivin gene promoter-driven stathmin siRNA expression vector may have potential use in tumor gene therapy with targeted tumor gene silencing effect.     

腺相关病毒携带hTERT启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤肿瘤细胞

背景与目的:腺相关病毒(adeno-associated virus)作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗研究.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosis.inducing ligand,TRAIL)基因可迅速诱导多种肿瘤细胞的凋亡.是一个安全有效的肿瘤杀伤基因.本研究旨在构建能在肿瘤细胞内特异性表达TRAIL基因的靶向腺相关病毒,并探讨其体外抗肿瘤效应的可能机制.方法:利用肿瘤特异性启动子端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcfiptase,hTERT)构建特异性杀伤肿瘤细胞的腺相关病毒载体pAAV-hTERT-TRAIL.通过与pAAV-Rc、pHelper共转染HEK293细胞包装出病毒AAV-hTERT-TRAIL.将该病毒体外转染人结肠癌SW620细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和正常细胞NHLF、MRC5后,检测TRAIL基因的肿瘤特异性表达.MTT法检测其对细胞增殖的影响,ELISA、Western blot法以及流式细胞仪检测细胞的凋亡,并分析其体外抗肿瘤效应的可能机制.结果:成功包装出病毒AAVhTERT-TRAIL.RT-PCR、Western blot和免疫组化法均证实AAV-hTERT-TRAIL能介导TRAIL基因在肿瘤细胞内特异性表达,但在正常细胞内不表达.以100 MOI AAV-IlTERTTRAIL感染细胞96 h后,SW620、A549和HepG2细胞的增殖率分别是41.55%、44.29%、49.95%,NHLF和MRC5细胞的增殖率分别是84.59%和87.22%.Western blot检测发现AAV-hTERT-TRAIL可激活Caspase通路.流式细胞仪和ELISA方法检测证实AAV-hTERT-TRAIL可诱导细胞凋亡.结论:hTERT的存在增强了腺相关病毒所携带TRAIL基因表达的肿瘤靶向性和对正常细胞的安全性.由它调控的杀伤基因可介导肿瘤细胞特异性的细胞毒效应.     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

重组survivin腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人基因的重组survivin腺病毒载体,为喉癌的基因治疗研究提供实验基础.方法 聚合酶链反应(PCR)克隆survivin基因,PCR产物与克隆载体连接、转化,鉴定阳性克隆测序后再与腺病毒骨架质粒同源重组,对重组克隆行PCR鉴定和Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定,并包装、纯化.结果 核酸序列分析证明,所克隆的survivin基因与文献报道一致,克隆成功,而且外源survivin基因正确地插入到腺病毒载体中,表明已成功构建腺病毒载体pLP-Ad-SUR.结论 重组survivin腺病毒载体构建成功.

Abstract：

Objective To construct a recombinant adenovirus of survivin vector and provid valuable reference for gene therapy of laryngeal cancer.Methods The survivin gene was cloned by PCR.After confirmation by enzyme restriction analysis and sequencing, the gene and the adenovirus vector were recombined together to construct the recombinant adenovirus vector.The recombinant adenovirus vector was confirmed via both sequencing and digestion restriction analysis, and then linearized and transfected into the HEK 293 cell line to generate recombinant adenovirus.Results The Sequence analysis demonstrated that the survivin gene sequence was the same as published in the literature, suggesting that a recombinant adenovirus vector has been successfully constructed.Conclusions A survivin recombinant adenovirus has been successfully constructed.     

人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA，体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链，再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应，以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP。所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRH-1表达下调，抑制率约达85％；同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE 1与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。