丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP1，已在GenBank中注册，注册号为AYll6969。NS3评1基因的编码序列全长为1932个核昔酸(nt)，编码产物由眺个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列，对其可能的氨基酸序列进行分析比较，并对其基因利用多聚酶链反应技术(PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现，为阐明HCVV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因2的克隆化研究

目的：对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)蛋白反式激活靶基因2(NS5A-TP2)的基因作克隆化研究。方法：依据我室构建的HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果，利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因NS5-ATP2的编码序列，对其氨基酸序列进行分析比较，并对其进行克隆化研究。结果：NS5A-TP2基因编码区为615核苷酸(nt)，编码产物为204氨基酸残基(aa)。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻，与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性，说明我们克隆的NS5A-TP2基因属于未知功能新基因。结论：发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为研究新基因的生物学功能及慢性丙型肝炎发病机制提供新的思路。     

HCV p7蛋白反式调节基因p7TP2的克隆化及生物信息学分析

目的:克隆HCV p7蛋白反式调节未知功能新基因p7TP2,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的 cDNA扩增p7TP2基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1／myc-His A,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位．结果:成功从HepG2细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因,编码区为495核苷酸(nt),编码产物为164氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因,并成功进行TA克隆,酶切、测序均正确,并进一步亚克隆至pcDNATM3．1／ myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于8q24．3,Mr17 146．5,理论pI:9．26,半衰期为30 h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含有潜在的三个螺旋区域,四个β折叠,四个蛋白激酶C磷酸化位点, 一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个N-肉豆蔻酰位点,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域．结论:发现了HCV p7反式调节新的靶基因, 构建了pcDNATM3．1／myc-HisA真核表达载体．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术（bioinformatics)，克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5AWll，新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt)，编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

新基因XTP3反式激活基因TPA的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法:依据我室构建的HBVX蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因XTP3TPA的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究.结果:发现了HBV XTP3反式激活作用的新的靶基因,命名为XTP3TPA.结论:这一发现为阐明HBVXTP3蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向.     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4的克隆化研究

目的 探索丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白反式激活作用的新的靶基因，以有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 应用表达谱芯片分析等分子生物学技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术，筛选、克隆HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3-core，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3-core转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆核心蛋白反式激活的新型靶基因，命名为HCTP4，新基因的编码基因序列全长为220个核苷酸(nt)，编码产物由748个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV核心蛋白是具有反式激活作用的蛋白。DNA微短阵技术(DNA mieroarray)是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因，此新基因的发现为深入研究HCV核心蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向。     

新基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6基因启动子转录活性的调节

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。方法以我室前期克隆的TAHCCP1基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学方法确定NS3TP6基因的启动子区域（NS3TP6-p）,聚合酶链反应（PCR）扩增并克隆至真核报告载体pCAT3-basic中,构建重组报告质粒pCAT3-NS3TP6-p;以该质粒单独或与pcDNA3．1（-）-TAHCCP1共转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性;观察细胞中表达的TAHCCP1蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。结果构建的重组表达载体pCAT3-NS3TP6-P在HepG2细胞中能够启动报告基因CAT表达,表明克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p与pcDNA3．1（-）-TAHCCP1组CAT的表达活性是对照组的3．1倍,说明TAHCCP1蛋白能够在转录水平反式激活NS3TP6基因启动子活性。结论本实验验证了基因芯片的实验结果准确性,进一步完善了新基因TAHCCP1的生物学功能,为深入理解HCV核心蛋白的反式激活调节机制提供了新的依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选HCV p7蛋白反式调节基因

目的应用基因芯片技术对pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-p7分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被HCV p7蛋白反式调节的靶基因,研究p7蛋白的生物学功能。方法以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增p7蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并逆转录成cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,有1个基因表达水平显著上调,22个基因表达水平显著下调。结论 HCV p7蛋白是一种反式调节因子,p7基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。     

Cloning and identification of NS5ATP2 gene and its spliced variant transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A

AIM: To clone, identify and study new NS5ATP2 gene and its spliced variant transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A. METHODS: On the basis of subtractive cDNA library of genes transactivated by NS5A protein of hepatitis C virus, the coding sequence of new gene and its spliced variant were obtained by bioinformatics method. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted to amplify NS5ATP2 gene. RESULTS: The coding sequence of a new gene and its spliced variant were cloned and identified successfully. CONCLUSION: A new gene has been recognized as the new target transactivated by HCV NS5A protein. These results brought some new clues for studying the biological functions of new genes and pathogenesis of the viral proteins.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因，研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术，以HCV NS5A表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP9，在GenBank中注册，注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt)，编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成，并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆，为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。     

Genes transactivated by hepatitis C virus core protein, a microarray assay

AIM: To explore the new target genes transactivated by hepatitis C virus (HCV) core protein and to elucidate the pathogenesis of HCV infection. METHODS: Reverse transcribed cDNA was subjected to microarray assay. The coding gene transactivated by HCV core protein was cloned and analyzed with bioinformatics methods. RESULTS: The expressive vector of pcDNA3.1(-)-core was constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing and approved correct. mRNA was purified from HepGZ and HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-core, respectively. The cDNA derived was subjected to microarray assay. A new gene named HCTP4 was cloned with molecular biological method in combination with bioinformatics method. CONCLUSION: HCV core is a potential transactivator. Microarray is an efficient and convenient method for analysis of differentially expressed genes.