大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养☆

背景：要获得满足临床需要的肌源性干细胞,体外筛选和扩增已成为关键环节。 目的：拟建立稳定高效的成年大鼠肌源性干细胞的分离培养、纯化方法。 方法：成年SD大鼠麻醉后,无菌条件下取骨骼肌,采用XI型胶原酶、Dispase和胰酶消化法获得肌源性干细胞,以密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。记录细胞生长曲线,MTT比色法观察不同接种密度对细胞生长的影响,采用免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。 结果与结论：原代肌源性干细胞体积较小,贴壁缓慢,折光性较好,多呈球形、梭形或纺锤形,增殖缓慢。传代培养后,加入含体积分数为20%血清浓度的完全培养基,以1×109 L-1密度接种时活细胞数量最多,为适宜接种密度,传1~4代细胞生长状态良好。免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sca-1(+),证实通过体外原代培养获得了高纯度的肌源性干细胞,并成功扩增。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响

背景：肌源性干细胞在体外培养过程中存在纯化、扩增、定向分化等难题,碱性成纤维细胞生长因子作为生物活性因子的一员,因其生物活性的多效性而备受关注。 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-04/07在沈阳医学院完成。 材料：健康雄性Wister大鼠5只,由沈阳医学院实验动物中心提供。碱性成纤维细胞生长因子为珠海生物制品有限公司产品。 方法：无菌条件下取大鼠左前肢肱三头肌,采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。取第2代肌源性干细胞,分别用终浓度为6.25,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/L碱性成纤维细胞生长因子进行干预;以单纯加入200 μL生长培养基作为空白对照组,以加入200 μL生长培养基+肌源性干细胞作为阴性对照组。分别于培养24,48,72,96 h加入MTT溶液。 主要观察指标：免疫细胞化学法鉴定大鼠肌源性干细胞,MTT比色法检测细胞增殖情况。 结果：肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应,少数呈Desmin阳性反应。①不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞的促增殖效应：与阴性对照组比较,各浓度碱性成纤维细胞生长因子组对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应(P < 0.05);浓度为6.25~50.00 μg/L时促增殖作用随其质量浓度升高而显著增强(P < 0.01),至50.00 μg/L时其促增殖作用接近顶峰。②碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干细胞的促增殖效应：随培养时间的延长肌源性干细胞明显增殖,与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组出现显著促增殖效应(P < 0.01)的时间为培养96 h。 结论：碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖,且呈浓度-时间依赖性增加,50.00 μg/L与96 h为较佳的体外培养质量浓度和时间。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。 目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。 方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM+体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基(HGM)+体积分数5%胎牛血清;HGM+5%正常大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清+25 μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。 结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景：传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制。 目的：拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞。 方法：抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力。取传至4~6代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定。 结果与结论：P5骨髓间充质干细胞(91.5±3.1)%处于G1期,高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节。骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达。表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞;在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。     

睫状神经营养因子和丹参注射液体外诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化

背景：在干细胞异体移植时神经细胞的低存活率成为异体细胞移植失败的主要诱因。核因子κB是细胞信号传导的主要转录因子之一，参与细胞的增殖和分化过程。 目的：观察睫状神经营养因子和丹参注射液联合诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化情况，以及分化过程中核因子κB的表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平实验，于2008-03/05在辽宁医学院附属第二医院口腔科学实验室完成。 材料：新生7 d龄SD乳鼠10只，由辽宁医学院实验动物中心提供。睫状神经营养因子为Sigma公司产品，丹参注射液购自正大青春宝药业有限公司。 方法：体外分离培养鼠肌源性干细胞，差速贴壁法和酶消化法纯化后接种于6孔板内，诱导组用含睫状神经营养因子的DMEM预诱导24 h，更换培养液，洗涤3次，再加入含丹参注射液的无血清DMEM诱导5 h；对照组使用无血清DMEM培养基处理。 主要观察指标：RT-PCR及Western blotting法检测神经丝蛋白、核因子κB抑制蛋白的表达。 结果：诱导前肌源性干细胞未见神经丝蛋白表达，诱导后的神经元样细胞神经丝蛋白呈阳性表达。凝胶电泳及Western blot检测结果显示，与诱导前比较，诱导后对照组核因子κB抑制蛋白的表达无明显变化，诱导组核因子κB抑制蛋白的表达明显下降。 结论：睫状神经营养因子和丹参注射液可联合诱导肌源性干细胞分化为神经元样细胞，分化过程中核因子κB的活化被抑制。     

生长因子对骨骼肌肌源性干细胞增殖的影响★

背景：单纯应用差速贴壁法获得的原代肌源性干细胞数量少，生长速度较慢，不利于获取满足实验及将来临床所需的细胞数量。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1在体外对体外培养肌源性干细胞增殖的作用，探索体外大量培养肌源性干细胞的方法和条件。 设计、时间及地点：观察对比实验，于2007-09/2008-04在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。 材料：2周龄体质量50~80 g的SD大鼠20只。 方法：采用改良差速贴壁培养法分离大鼠骨骼肌肌源性干细胞：取新生大鼠肌肉标本分离细胞；维持总的贴壁时间基本不变，减少贴壁次数，取第2代肌源性干细胞进行体外成肌分化。 主要观察指标：以免疫细胞化学法及免疫荧光法鉴定肌源性干细胞。以MTT 比色实验检测5，10，20，40，80 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞增殖的影响。以流式细胞仪检测碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1 和胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对细胞周期的影响。 结果：肌源性干细胞原代培养70 h后开始贴壁，呈规则的圆形。1周后细胞数量增多，细胞展开呈纺锤性。免疫细胞化学染色法和细胞免疫荧光法显示肌源性干细胞呈结蛋白、干细胞抗原1和CD34阳性。传代细胞加入碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1后肌源性干细胞的增殖活性增强，两种细胞因子作用强度相近，随着两种细胞因子浓度的提高促细胞增殖作用逐渐提高,在达到有效浓度后作用趋于饱和。两种细胞因子作用机制不同，碱性成纤维细胞生长因子主要是增加G2M期的细胞比例，通过缩短细胞周期达到增殖作用, 胰岛素样生长因子1则主要增加S期细胞的比例，通过活化由G0期到G1期转化的进入有丝分裂细胞来达到增殖作用。 结论：胰岛素样生长因子1 和碱性成纤维细胞生长因子都具有刺激肌源性干细胞增殖的作用，两者联合作用既可以增加早期由G0期进入G1期的数量，又可以减短细胞有丝分裂周期，从而达使促增殖效果更快、更强。     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化*

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。 目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O2)或低氧(体积分数3%O2)环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1 µg/L胶质源性神经营养因子。 结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用*

背景：有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达。 目的：在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用。 方法：购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3~5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104个/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用。复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上。在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组：对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组)。各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统统计阳性细胞数及平均吸光度值。 结果与结论：与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P < 0.01), Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P < 0.01)。证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。     

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞*☆

背景：研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞，并应用于各类组织工程和再生医学研究。 目的：结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞，并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。 方法：以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象，经三重酶消化和细胞筛过滤，运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞，予细胞特异标记物以免疫组织化学染色；以有限稀释技术克隆培养的方法，获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。 结果与结论：差速贴壁培养过程中，肌性细胞占比逐渐增高，首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养；肌源干细胞需72 h左右贴壁生长，经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落，细胞形态以小圆形细胞为主，并有少量梭形细胞，肌源干细胞能够维持形态并持续增殖；应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落，肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性，Sca-1染色阳性，阳性率为(92.3±4.1)%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。     

血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤干细胞

背景：细胞周期分析已证实,90%以上的干细胞处于G0静止状态,因此采用不含任何生长因子和其他相关营养添加剂的血清剥夺培养基更适合筛选分离肿瘤干细胞。 目的：应用血清剥夺法培养胶质瘤U87细胞,并筛选鉴定该细胞系中的胶质瘤干细胞。 方法：将U87细胞培养在只含有DMEM和L-谷氨酰胺的培养基中培养6 d,筛选出胶质瘤干细胞,接着更换为神经干细胞培养基,观察细胞肿瘤球的形成过程;将肿瘤球接种于血清培养基,观察其在体外的分化特点;免疫荧光鉴定血清剥夺后尚存的细胞、增殖形成的肿瘤球细胞和分化细胞。 结果与结论：应用血清剥夺的方法成功地筛选出了表达CD133的肿瘤干细胞,并能增殖形成肿瘤球;肿瘤球可多向分化,子代细胞表达胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶。说明U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞。