紫外线诱导角质形成细胞凋亡和表没食子儿茶酚没食子酸酯保护机理的探讨

目的探讨不同剂量的中波紫外线(UVB)辐射对体外培养的人角质形成细胞(HaCaT细胞株)凋亡和死亡的影响,探讨表没食子儿茶酚没食子酸酯(EGCG)对此影响的保护作用,以及与凋亡相关的bcl-2和Fas基因之间的关系。方法流式细胞仪检测不同剂量UVB辐照及EGCG处理后角质形成细胞凋亡和死亡数量以及bcl-2蛋白水平的变化,RT-PCR检测FasmRNA的表达水平。结果UVB辐照组凋亡细胞数和死亡细胞数显著高于对照组(P<0.01),bcl-2和FasmRNA量与对照组差异也有显著性(P<0.01)。UVB辐照126mJ/cm2组凋亡细胞数低于辐照42mJ/cm2组(t=2.39,P<0.05),但死亡细胞比例显著增加(t=4.82,P<0.01),两组bcl-2和FasmRNA表达量差异均无显著性(t=1.30,P>0.25;t=0.32,P>0.25)。UVB辐照42mJ/cm2立即加入EGCG组较辐照42mJ/cm2未加EGCG组凋亡和死亡细胞数降低(t=7.64,P<0.01;t=3.49,P<0.05),bcl-2增加(t=3.62,P<0.05),FasmRNA表达量减少(t=6.83,P<0.01)。结论小剂量UVB辐照可以诱导体外培养的角质形成细胞凋亡,大剂量UVB辐照则导致细胞死亡,EGCG通过与凋亡相关的bcl-2和Fas减少紫外线诱导的角质形成细胞凋亡。     

GATA结合蛋白3转录调控星形胶质细胞上调基因-1表达对子宫内膜癌细胞增殖､侵袭的影响

目的研究GATA结合蛋白3(GATA3)转录调控星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)表达对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的影响。方法体外培养人子宫内膜癌原代培养细胞、人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A、Ishikawa及HEC-1-B、人子宫内膜上皮细胞hEEC。将HEC-1-A细胞随机分为对照组、GATA3过表达质粒组、GATA3空载质粒组、GATA3 siRNA组、GATA3 siRNA阴性对照组,分组转染后,CCK-8实验评测各组细胞增殖情况;流式细胞实验评测各组细胞凋亡情况;细胞划痕、Transwell侵袭实验分别评测各组细胞迁移侵袭情况;qRT-PCR实验评测各组细胞GATA3与AEG-1的表达;免疫印记实验评测各组细胞凋亡蛋白caspase-9、Bax及EMT标志蛋白E-cadherin、Vimentin表达。同样方法分组转染人子宫内膜癌原代培养细胞后,检测各组细胞增殖、侵袭情况。结果与人子宫内膜上皮细胞比较,人子宫内膜癌原代培养细胞、人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A、Ishikawa及HEC-1-B细胞中GATA3、AEG-1表达明显升高(P<0.05)。与对照组比较,GATA3过表达质粒组HEC-1-A细胞活力(包括人子宫内膜癌原代培养细胞)、迁移距离、侵袭细胞数(包括人子宫内膜癌原代培养细胞)、GATA3与AEG-1 mRNA表达水平、Vimentin表达升高(P<0.05),HEC-1-A细胞凋亡率、caspase-9、Bax及E-cadherin表达降低(P<0.05);GATA3 siRNA组呈相反趋势(P<0.05);GATA3空载质粒组、GATA3 siRNA阴性对照组各指标无明显差异(P>0.05)。结论下调GATA3表达,可降低AEG-1表达,抑制子宫内膜癌细胞增殖及侵袭迁移,促进其凋亡。     

芪加真武汤对系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞凋亡及Fas和FasL表达的影响

目的探讨中药芪加真武汤对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞(PBL)凋亡及Fas和FasL表达的影响。方法采用血清药理学的原理制取兔芪加真武汤含药血清。选取活动期SLE患者19例和正常人10名,分离PBL,将植物血凝素刺激后的PBL分别加入RPMI1640(含10%小牛血清)、含药血清(5%,10%,20%)培养72h,应用流式细胞仪检测其凋亡及Fas和FasL的表达。结果①SLE患者PBL凋亡率明显高于正常人(P<0.01),Fas表达明显升高(P<0.01)。②10%,20%含药血清组PBL的凋亡均较SLE显著减少(P<0.01),Fas表达显著降低(P<0.01),FasL的阳性表达率升高(P<0.05)。结论SLE患者PBL存在凋亡及Fas和FasL表达的紊乱。中药芪加真武汤可降低SLE患者外周血淋巴细胞Fas的表达和增加FasL的细胞阳性表达率,进而影响其凋亡。     

白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究

目的:研究白癜风白斑处黑素细胞分布及酪氨酸酶(TYR)等标记分子的表达情况。方法:对吸疱法所取白斑皮肤以免疫组化染色识别TYR、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和HMB-45,以Mias99彩色图像分析软件定量图像分析阳性表达的强弱。结果:白斑处黑素细胞数目明显低于正常对照(P<0.01),患者非皮损处与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)。皮损处黑素细胞树突减少,平均为3.4个,低于对照组(P<0.05)。残留黑素细胞各抗体呈强阳性染色。白斑毛囊之间可见黑素细胞散在、呈围管样分布。白斑处阳性细胞HMB-45图像灰度值低于正常着色皮肤(P<0.05),而TRP1高于正常皮肤(P<0.01),TYR与正常皮肤无差异(P>0.05)。结论:白斑处仍然有黑素细胞。残存黑素细胞树突回缩、数目变少,而且黑素细胞中黑素细胞标记分子表达异常。     

内皮素3/内皮素受体B对A375细胞NF-KB/Bcl-2相关蛋白A1抗凋亡通路的调节北大核心CSCD

目的研究内皮素3(ET-3)对人恶性黑素瘤(MM)A375细胞核因子(NF)-κB/Bfl-1抗凋亡通路的调节。方法用ET-3(100 nmol/L)刺激A375细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率。RT-PCR及Western印迹测定不同浓度ET-3(0、1、10、100 nmol/L)及其与内皮素受体B(ETRB)阻断剂BQ788联合干预A375细胞后,Bfl-1在mRNA和蛋白质水平的表达。Western印迹检测相同条件干预下磷酸化NF-κB(pNF-κB)的蛋白表达。结果 ET-3可以降低A375细胞的凋亡率(F=10.68,P<0.05)。ET-3对A375细胞Bfl-1 mRNA和蛋白表达水平的影响呈浓度依赖性上调,BQ788明显阻断ET-3上调Bfl-1的效应(P<0.01)。Western印迹检测结果显示,ET-3显著上调pNF-κB的表达(P<0.05),BQ788干预下其表达水平降低,接近对照组,ET-3(100 nmol/L)+BQ788组与100 nmol/L ET-3组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ET-3/ETRB通过激活NF-κB/Bfl-1抗凋亡通路抑制A375细胞凋亡。     

Survivin和Bcl-2在尖锐湿疣中的表达

目的:测定survivin和Bcl-2在尖锐湿疣(CA)组织中的表达并探讨两者表达的关系。方法:应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶方法(SP法)分别检测60例CA组织及10例正常包皮组织中survivin、Bcl-2基因的表达。在镜下观察切片并计算阳性细胞百分比。结果:CA组织中survivin的表达率为86.67%,显著高于正常包皮的表达率20%(P<0.01)。其中棘层的表达率85.00%显著高于基底层的表达率70.00%和颗粒层的表达率66.67%(P<0.05),基底层与颗粒层的表达率之间无显著性差异(P>0.05)。Bcl-2在CA的表达率为66.67%,正常包皮组织中未见Bcl-2蛋白表达。survivin在CA中的表达与Bcl-2呈正相关(P<0.01)。结论:本实验检测出survivin基因在CA组织中有异常表达,提示survivin蛋白引起的细胞凋亡抑制在CA的发生中起到重要的作用。survivin与Bcl-2在CA的发生发展过程中起到协同作用。     

HSV-2型糖蛋白G基因免疫优势表位片段的克隆和表达

目的:通过基因工程技术,克隆和表达单纯疱疹病毒2型糖蛋白G(HSV-2 gG)基因的免疫优势表位片段。方法:用PCR技术扩增HSV-2 gG基因的免疫优势表位片段;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果:PCR法扩增出1 242 bp的DNA片段;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片段,其中99.5%序列与目的基因序列一致。SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论:HSV-2 gG基因的免疫优势表位片段的成功表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础。     

阿魏酸钠对体外培养人真皮中成纤维细胞EGF表达的影响

目的观察中药当归活性成分阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)对人真皮成纤维细胞(fibroblast,FB)中表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)表达的影响。方法体外培养人真皮FB,用MTT法检测10μmol/L,30μmol/L,60μmol/L,125μmol/L,250μmol/L,500μmol/L和1 000μmol/L等不同浓度SF对FB增殖的影响;并用ELISA法分别重点观察SF 125μmol/L,250μmol/L和500μmol/L于24h,48h和72h时细胞上清液中EGF含量(pg/mg protein)。结果 10μmol/L,30μmol/L,60μmol/L,125μmol/L,250μmol/L和500μmol/L等不同浓度SF对FB增殖无明显影响(P>0.05),1 000μmol/L时细胞增殖显著性降低(P<0.05)。125μmol/L组24h,48h与72h EGF含量分别为548.23±137.28,589.25±120.28和654.28±132.10;250μmol/L组24h,48h和72h分别为589.65±157.29,701.27±193.47,745.23±129.43;500μmol/L组24h,48h和72h分别为757.24±111.47,903.24±134.12和950.76±129.28。125,250μmol/L组72h与24h比较明显升高(P<0.05),与48h比较无明显差异(P>0.05);500μmol/L组72h与48h比较明显升高(P<0.05),与24h比较显著性升高(P<0.01)。此外,125μmol/L和250μmol/L组24h与对照组比较无明显差异(P>0.05),500μmol/L组则显著性升高(P<0.01)。125μmol/L组48h与对照组比较无明显差异(P>0.05),250μmol/L,500μmol/L组较对照组显著性升高(P<0.01)。125μmol/L,250μmol/L和500μmol/L组72h时较对照组均显著性升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。对照组不同时间比较无明显差异(P>0.05)。结论 当归活性成分SF能增强人体真皮成纤维细胞EGF的表达,且具有显著的剂量依赖性及时间依赖性。     

MEK/ERK通路阻断剂对黑素瘤细胞增殖的影响

目的研究MEK/ERK通路阻断剂U0126对黑素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法噻唑蓝法(MTT)测定U0126和传统抗癌药物达卡巴嗪(DTIC)分别及联合作用时对黑素瘤细胞A375的增殖抑制作用;流式细胞术检测不同药物处理组的细胞周期及凋亡情况;Western blot检测U0126处理后细胞p-ERK1/2的表达。结果药物作用24h时U0126单一用药组对细胞的增殖抑制率高于DTIC单一用药组(P<0.01);联合应用U0126和DTIC对细胞的增殖抑制率明显高于DTIC用药组(P<0.01);U0126组与对照组相比,G1期细胞比例数提高了21.83%(P<0.01),凋亡率提高了13.96%(P<0.01),联合用药组与对照组相比G1期比例增加了26.64%(P<0.01),凋亡率亦明显提高了25.20%(P<0.01);不同浓度U0126处理细胞后,细胞的p-ERK1/2均明显降低(P<0.01)。结论 MEK/ERK通路阻断剂U0126可显著抑制黑素瘤细胞的增殖,其机制可能与降低p-ERK1/2的表达从而参与细胞周期调控有关;联合U0126用药有望成为治疗黑素瘤新的有效途径。     

黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统选择性杀伤黑素瘤细胞

目的:探讨黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,对黑素瘤细胞A375的选择性杀伤作用。方法:构建腺病毒穿梭质粒pAdrMIA-CD/TK,在293细胞内包装、扩增、纯化后,体外转染人表皮黑素细胞HeMa-LP、黑素瘤细胞A375和人宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测基因CD和TK片段,加入前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或丙氧鸟苷(GCV),用MTT法测定该体系对细胞株的杀伤效应。结果:制备的病毒滴度为1×1011pfu/L,用100m.o.i.重组腺病毒感染细胞后,发现目的基因CD和TK片段可在黑素瘤细胞中表达,转染目的基因的黑素瘤细胞A375对5-FC和GCV具有一定的敏感性,细胞存活率较对照组显著下降(P<0.05),联合应用两种药物对A375细胞的杀伤作用较单用一种显著增强(P<0.05)。对人表皮黑素细胞HEMa-LP和人宫颈癌细胞HeLa无显著杀伤作用。结论:构建的黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,在体外可选择性杀伤黑素瘤细胞A375。     

Ro60 cDNA的克隆及其重组杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人Ro60cDNA的杆状病毒表达载体。方法 采用逆转录-PCR技术从Hela细胞RNA中扩增Ro60cDNA,定向插入杆状病毒转移载体pFastBacHTc,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid,通过蓝白斑筛选和PCR进行鉴定。结果 成功从Hela细胞RNA中扩增出1.56kbRo60,所克隆的Ro60cDNA与已公布的序列完全符合,证明本克隆为Ro60cDNA的精确拷贝,并证实其目的基因与重组载体发生了特异转座和病毒重组,成功地构建了重组杆状病毒表达载体Bacmid-Ro60。结论 本实验成功克隆了Ro60cDNA并构建了其杆状病毒表达载体,为进一步表达Ro60蛋白和研究此抗原在红斑狼疮的发病机制奠定了基础。     

银屑病患者皮损白介素8受体A、B及肿瘤坏死因子受体P55和P75的表达

目的：研究银屑病皮损白介素8受体A、B及肿瘤坏死因子受体P55和P75的表达，以了解其在银屑病发病中的作用。方法：采用ABC免疫组化法对银屑病皮损、皮损周边外观正常皮肤及皮疹消退后的正常皮肤白介素8和肿瘤坏死因子受体表达进行染色。结果：正常对照皮肤未见白介素8受体及肿瘤坏死因子受体表达。皮损部位真皮浸润的单一核细胞可表达白介素8受体A，皮损表皮及皮疹周边外观正常皮肤及皮疹消退后的正常皮肤表皮可表达白介素8受体B及肿瘤坏死因子受体P55和P75，但皮损部位表达水平明显高于非皮损处，而皮损处肿瘤坏死因子受体P55表达强度又明显高于P75。结论：银屑病皮损白介素8受体及肿瘤坏死因子受体的异常表达，尤其是肿瘤坏死因子受体P55的高表达，可能在银屑病发病中具有一定意义。     

淋球菌经NF-κB途径诱导Hela细胞NALP3表达的研究

目的：确定NALP3在淋球菌诱导的人宫颈癌细胞（Hela）促炎细胞因子产生中的作用及其激活途径。方法：将Hela细胞分为空白对照组、Bayll-7082抑制剂组、淋球菌组和淋球菌＋Bayll-7082抑制剂组。荧光定量PCR检测Hela细胞内NALP3mRNA表达,WesternBlot检测Hela细胞核内NF-κBp65和胞质内caspase-1p20蛋白质水平,酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组细胞培养上清液中ITJ-1β的含量。结果：淋球菌组细胞内NAIU3mRNA表达是空白对照组的5．8倍,核内NF-κBp65和胞质内caspase-1p20蛋白质水平是空白对照组的3．2倍和3．1倍,细胞培养上清液中的IL-1G含量显著高于对照组（P〈0．01）。结论：淋球菌通过活化NF-κＢ诱导Hela细胞NALP3的表达并活化caspase-1和IL-1β。     

InnVit基因对B10BR细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 分析InnVit基因的抑制和过表达对永生化黑素细胞株B10BR细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨InnVit基因的生物学功能及其对白癜风中黑素细胞缺失的影响。方法 化学合成InnVit基因特异性siRNA片段以及构建过表达质粒载体P3XF-P120,lipofectamineTM 2000脂质体方法转染B10BR细胞。半定量RT-PCR法检测InnVit基因mRNA水平;Western印迹检测该蛋白水平变化;MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞技术分析细胞周期和凋亡的变化。结果 InnVit基因抑制后mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,InnVit基因过表达质粒组mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组;转染后24、48、72 h抑制组的细胞存活量极显著下降（P < 0.01）,过表达质粒组的细胞存活量在48和72 h极显著增加（P < 0.01）。转染后48 h基因抑制组的早期凋亡率从（10.24 ± 1.00）%升至（37.34 ± 3.26）%,过表达质粒组早期凋亡率从（14.58 ± 1.49）%降至（8.43 ± 0.86）%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）;转染48 h基因抑制组的G1期细胞由（56.11 ± 5.46）%增至（69.76 ± 6.08）%（P < 0.05）,过表达质粒组的G1期细胞由（55.14 ± 5.65 ）%降至（29.33 ± 3.01）%（P < 0.01）。结论 InnVit基因抑制使细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡;InnVit基因的过表达增强了细胞的增殖能力,抑制细胞凋亡。其增殖能力的改变可能是通过细胞周期的调控调节的。     

孕激素对淋球菌诱导Hela细胞NALP3炎性体表达的影响

目的 探讨孕激素对淋球菌(Ng)诱导的人宫颈癌细胞(Hela)NALP3炎性体基因表达的影响。方法 将体外培养的Hela细胞分为5组,即空白对照组、Ng组、Ng+10-9mol/L孕酮组、Ng+10-8mol/L孕酮组和Ng+10-7mol/L孕酮组。荧光定量PCR检测Hela细胞内NALP3mRNA表达,WesternBlot检测Hela细胞内NF-κBp65和caspase-1p20活性的变化,酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定各组细胞培养上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)的含量。结果 Hela细胞在淋球菌的刺激下,细胞内NALP3mRNA表达、NF-κB和caspase-1p20活性、细胞培养上清液中的IL-1β含量均明显升高,Ng组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);加入孕酮干预后,随着孕酮浓度的增高,细胞内NALP3mRNA表达、NF-κB和caspase-1p20活性、细胞培养上清液中的IL-1β含量明显降低,与Ng组比较,差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论 孕酮可抑制淋球菌诱导的NALP3表达及caspase-1的活化和IL-1β的分泌,且这种抑制作用可能是通过抑制NF-κB活性实现的。     

生长抑制因子4对黑素瘤M14细胞增殖的影响

目的 构建人生长抑制因子4基因的真核表达质粒,并将其转染入黑素瘤M14细胞,观察生长抑制因子4对M14细胞增殖的影响。方法 通过RT-PCR法从人正常胃黏膜组织获得目的基因片段,将其克隆入空载质粒pCDNA3.1,构建真核表达载体pCDNA3.1-ING4,采用PCR及基因测序等方法进行鉴定。将其转染入黑素瘤M14细胞,检测生长抑制因子4的表达情况及对M14细胞增殖的影响。结果PCR所得产物为约750 bp的DNA片段,与预测大小相符,DNA序列测定与报道结果一致。蛋白印迹及免疫细胞化学法均显示转染外源生长抑制因子4基因的M14细胞有更高的生长抑制因子4（ING4）表达,细胞活力及生长速度明显低于转染空载质粒的M14细胞和未转染的M14细胞。结论 成功构建了重组人生长抑制因子4基因表达质粒pCDNA3.1-ING4,转染的外源生长抑制因子4基因可在细胞内表达并对M14细胞的增殖起抑制作用。     

RNA干扰p53基因表达对人皮肤成纤维细胞衰老的影响

目的 建立抑制p53基因表达的人皮肤成纤维细胞（HSF）,探讨抑制p53表达对HSF衰老的影响。方法 脂质体转染法将针对p53的shRNA的真核表达质粒pGCsi-p53导入HSF中,经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立稳定转染克隆细胞系。用RT-PCR、实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。通过SA β-gal染色法检测细胞衰老,MTT法检测细胞增殖能力。 结果 成功建立RNA干扰抑制p53表达的HSF细胞系,转染细胞中p53基因及蛋白水平明显下调（P < 0.01）。SA β-gal染色结果显示,转染组衰老细胞百分比（13.47% ± 1.01%）与对照组（18.10% ± 0.66%）相比降低（P < 0.05）,MTT检测结果显示,转染组细胞增殖能力较对照组加快（P < 0.05）。结论 抑制p53表达能够延迟HSF的衰老,促进细胞增殖。     

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过HMGB1抑制细胞凋亡机制初步研究

【摘要】 目的 探讨pORF5质粒蛋白抗凋亡分子机制,为进一步阐明沙眼衣原体致病机制提供实验依据。方法 将HeLa细胞分为两组,一组用凋亡诱导剂碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）刺激30 min,另一组经pORF5质粒蛋白预处理18 h后,再用CCCP刺激30 min。然后,Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3（caspase-3）的表达水平;JC-1荧光探针检测HeLa细胞线粒体膜电位变化;间接免疫荧光观察细胞色素c释放情况。为了分析高迁移率族蛋白1（HMGB1）是否参与pORF5质粒蛋白的抗凋亡作用,分别用HMGB1 shRNA和对照RNA稳定转染HeLa细胞,再用pORF5质粒蛋白与CCCP共刺激两种细胞后,测定Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白的表达以及细胞色素c的释放情况。两组间比较采用配对样本t检验。结果 pORF5质粒蛋白能拮抗CCCP 诱导的线粒体膜电位的下降,CCCP单独处理组Hela细胞红/绿荧光强度比率为0.4 ± 0.1,显著低于pORF5与CCCP共处理组（1.7 ± 0.3,t = 6.95,P < 0.01）。与对照组相比,pORF5与CCCP共处理组HeLa细胞Bcl-2蛋白表达水平增加（5.3 ± 0.6）倍（t = 8.62,P < 0.01）,而Bax和活化的caspase-3平均表达水平分别降低79% ± 10%（t = 9.23,P < 0.01）和75% ± 8%（t = 4.26,P < 0.05）。与对照RNA转染组相比,HMGB1 shRNA转染组HeLa细胞线粒体膜电位下降（t = 11.23,P < 0.01）,细胞色素c释放增加,Bcl-2的表达水平降低（t = 7.19,P < 0.05）,而Bax的表达水平增加（t = 13.06,P < 0.01）。结论 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过HMGB1阻断线粒体凋亡途径发挥抗凋亡作用。     

DNA依赖的蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞的研究

目的：探讨DNA—PK和CHK1对卵巢癌Skov3的细胞周期阻滞的机制。方法：通过对DNA—PKshRNA和CHKlshRNA的构建及有效干扰载体的筛选,流式细胞仪检测G2期。结果：转染DNA—pKshRNA的Skov3细胞和Hela细胞经2GyX射线照射后进入G2期的细胞比率无差异;转染CHK1shRNA的Skov3细胞经2GyX射线照射后4h进入e2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2．618,P=0．026）,28h时明显低于Hela细胞（t=2．705,P=0．022）;转染DNA—PKshRNA和CHK1hRNA的Skov3细胞经2Gyx射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2．965,P=0．014）,28h时明显低于Hela细胞（t=2．302,P=0．044）。结论：干扰DNA—PK和CHK1的表达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性。     

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡北大核心CSCD

目的 探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对肿瘤坏死因子α（TNF？α）诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法 将含pORF5基因的慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染293T细胞制备慢病毒,慢病毒收集浓缩后再感染HeLa细胞,流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株（pORF5？HeLa）,同时建立空载体转染对照细胞株（对照HeLa）。将两种细胞株分别分为两组,一组用20 μg/L TNF？α处理（处理组）,一组仅用新鲜培养基培养（未处理组）,作用6 h,Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时 PCR检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl？2和Bax mRNA表达水平,Western印迹检测Bax、Bcl？2蛋白表达水平。结果 TNF？α处理细胞6 h后,Hoechst33258染色发现pORF5？HeLa和对照HeLa细胞中均可见不同程度的核固缩、碎裂,高亮蓝色凋亡小体;pORF5？HeLa细胞的凋亡率为（35.5 ± 4.5）%,对照HeLa细胞凋亡率为（63.6 ± 5.8）%,均显著高于相应未处理组［（9.5 ± 1.5）%和（7.9 ± 0.9）%,t值分别为13.53、32.36,均P 〈 0.01］。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%（t值分别为35.29,42.25,均P 〈 0.01）,但Bcl？2 mRNA的表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞（t = 87.12,P 〈 0.01）。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax蛋白表达水平亦显著低于处理组对照HeLa细胞（t = 17.58,P 〈 0.01）,而Bcl？2蛋白表达水平较对照HeLa细胞增加6.8倍,差异有统计学意义（t = 18.93,P 〈 0.01）。结论 pORF5可能通过增强抗凋亡蛋白Bcl？2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达,抑制TNF？α诱导的HeLa细胞凋亡。