hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。     

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在A549中的表达

目的 建立人核心蛋白聚糖(decorin,DCN) 真核表达载体,并在A549细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 用PCR法扩增出DCN分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染A549细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达.结果 获得了约1 080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中.RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和Western印迹方法可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染DCN的A549细胞株.     

磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体的构建及鉴定

目的构建磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）,并进行酶切鉴定。方法查得人SLC34A2cDNA全序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过RT-PCR获得SLC34A2基因,定向插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1（＋）-SLC34A2,通过酶切分析,PCR及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果从正常肺组织中逆转录扩增出的SLC34A2基因,大小约为2073bp,经双酶切及测序鉴定证明成功构建了SLC34A2真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC34A2。结论RT-PCR扩增得到了大小约为2073bp的SLC34A2基因;并成功构建了pcDNA3.1（＋）-SLC34A2真核表达重组载体。     

人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础.方法 从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体中.通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性.提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株.提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达.结果 从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基.测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列.转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P＜0.01.结论 成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体.获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株.     

核心蛋白聚糖在HepG2细胞中的表达及作用

目的 构建分泌型核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体,并观察其在肝癌细胞HepG2中的表达和抗肿瘤作用.方法 应用PCR技术扩增DCN全长基因eDNA片段,与pcDNA3.1载体连接,并转化到大肠杆菌中扩增获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体,脂质体介导转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,采用RT-PCR、免疫组化检测其表达.MTT检测细胞增殖活力,流式细胞仪分析细胞周期.结果 RT-PCR可见转染组细胞mRNA表达明显增多,免疫组化可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.细胞生长曲线显示转染组细胞生长缓慢,G,期细胞显著增多.结论 本方法可成功建立稳定转染DCN的HepG:细胞株,并证实DCN能够抑制HepG:细胞株的生长.     

人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho（hsKL）蛋白，制备具有天然结构的重组hsKL（rhsKL）蛋白。方法 用PCR法自克隆载体pBS—hsk1中克隆hsKL DNA，构建真核表达载体pcDNA3．1／Zeo（＋）-hskl。经核酸测序确证后，阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆，SDS—PAGE（银染色）法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量，Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白，确定稳定转染细胞株CHO—hsKL。结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的bskl mRNA序列一致。将hsKL DNA定向插入pcDNA3．1／Zeo（＋），构建pcDNA3．1／Zeo（＋）．hsk1真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS—PAGE和Western blot分析显示，转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO—hsKL。     

锚定修饰的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI的构建及鉴定

目的为研究锚定修饰的rmCGβ-IgGFc-GPI的新功能和免疫治疗奠定基础。方法应用基因工程技术将pCI-IgGFc-GPI质粒经双酶切后,插入pcDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Ig-GFc-GPI,然后再插入经双酶切的恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基（rmCGβ亚基）,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,流式细胞仪技术和细胞免疫荧光法检测B16细胞中表达的IgGFc段融合蛋白。结果酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI,流式细胞仪技术和细胞免疫荧光法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达目的蛋白;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI。结论锚定修饰的rmCGβ亚基的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-rmCGβ-IgGFc-GPI成功构建,且能在B16细胞内表达;为进一步研究锚定修饰的rmCGβ-IgGFc-GPI的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

β-防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa1-6中的稳定表达

目的 克隆抗菌肽β防御素2(mBD2)基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa1-6细胞中稳定表达.方法 Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RT-PCR扩增mBD2成熟肽基因,Overlap-PCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),PCR、酶切和测序鉴定正确后,脂质体法转染Hepa1-6细胞,G418筛选,RT-PCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达.结果 成功克隆含有信号肽的IgК-mBD2序列,并且构建pcDNA3.1(+)/IgК-mBD2真核分泌性表达载体,实现了mBD2分子在Hepa1-6细胞中稳定表达,RT-PCR从细胞总RNA中扩增得到202 bp的IgК-mBD2基因,Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/IgК-mBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa1-6细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定.用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况. 结果限制性内切酶分析与测序结果示H /K ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性.认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础.     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

人miR-205真核表达载体的构建及鉴定

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,并使其在肾上腺皮质癌细胞SW-13中稳定表达。方法依据miRbase数据库中pre-miR-205序列设计引物,PCR扩增pre-miR-205基因并将其克隆至线性化的pcD-NA3.1(+)质粒中,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,经双酶切及测序分析后,将其及对照空载体转染肾上腺皮质癌SW-13细胞,采用实时定量RCR法鉴定miR-205在SW-13细胞中表达。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1(+)-205重组质粒构建成功,经实时定量RCR检测表明转染pcDNA3.1(+)-205的SW-13细胞中miR-205阳性高表达。结论真核表达载体pcDNA3.1(+)-205在SW-13中稳定转染,为进一步研究miR-205在肾上腺皮质癌细胞SW-13中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

马来丝虫肌球蛋白部分编码基因Bm-M55的克隆与真核表达

根据马来丝虫肌球蛋白部分编码基因（Bm-M55）序列设计引物,以其微丝蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增目的基因。用TA克隆方法将目的基因克隆至载体pGEM?鄄T Easy中,经PCR和双酶切鉴定并测序后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）/Bm-M55,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）对获得重组蛋白Bm?鄄M55进行分析和鉴定。RT-PCR鉴定结果显示, 转染的COS-7细胞表达了Bm-M55基因,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank（登录号为AAA27858）中的一致,重组蛋白Bm-M55相对分子质量（Mr）约为 55 000。     

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆与真核表达

目的克隆结核杆菌新抗原Mtb8．4基因，导入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4，并在真核细胞中进行表达。方法提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增，获得Mtb8．4目的基因后，与pcDNA3．1（＋）载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48k后，用RT-PCR方法鉴定Mth8.4在转录水平的表达情况。结果pcDNA3．1（＋）．Mth8．4真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，Mtb8．4在转录水平成功表达。结论pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4真核表达质粒的构建成功以及Mtb8．4在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4DNA疫苗奠定了基础。     

鲎抗脂多糖因子的基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的构建中国鲎的鲎抗脂多糖因子(LALF)基因序列的真核表达载体并尝试其在真核细胞COS-7中的表达。方法从鲎血细胞中提取mRNA,经RT-PCR扩增出LALF的基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)中进行酶切鉴定和序列测定,重组载体通过脂质体转染COS-7细胞进行表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有LALF的基因片段。经RT-PCR证实转染的COS-7细胞含有LALF的基因序列,经SDS-PAGE分析表明转染重组质粒的COS-7细胞表达融合蛋白。结论LALF真核表达载体构建成功并实现其在真核细胞COS-7中的表达,为进一步探讨rLALF的生物活性奠定了基础。     

人破骨细胞分化因子基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人破骨细胞分化因子(ODF)基因并在真核细胞中表达。方法 以人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA为模板，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法得到ODF的编码区cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ODF，在脂质体介导下转染非洲绿猴肾细胞系(COS)-7，经G418压力筛选建立稳定转染人ODF的细胞系，Western印迹检测其在COS7细胞中的表达。结果获得的人ODFcDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致，Western印迹证实稳定转染人ODF的COS7细胞系中有ODF的表达。结论 构建了人破骨细胞分化因子(ODF)的真核表达载体，并在COS7细胞中获得稳定表达。     

VEGF真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建血管内皮生长因子（vascu lar endothelial growth factor,VEGF）真核表达载体,并研究其在骨髓间充质干细胞（m esenchym al stem cells,MSCs）中的表达情况。方法运用DNA重组技术,构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,将载体转染大鼠MSCs,RT-PCR,ELISA及免疫细胞化学等方法检测VEGF在大鼠MSCs中的表达情况,MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF的生物活性。结果成功构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,其转染后的大鼠MSCs中VEGF表达水平明显增高,转染后细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论VEGF真核表达载体转染大鼠MSCs后能有效增加VEGF表达,并表现出较强的促内皮细胞增殖作用。     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建

目的：建立稳定高表达重组人组织激肽释放酶7基因（ KLK7）的前列腺癌细胞株DU145,为前列腺癌发生机制的研究奠定基础。方法 PCR法扩增KLK7 cDNA,并克隆到真核表达载体pcDNA3．1上;经过限制性内切酶酶切、DNA测序验证正确后,以脂质体法转染人前列腺癌DU145细胞;通过G418筛选,每个单克隆细胞扩大培养,建立稳定转染KLK7的DU145单克隆细胞株。采用Western blot 法检测DU145细胞株KLK7表达。结果酶切鉴定及DNA 测序分析显示 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体成功构建;转染后,成功获得稳定高表达KLK7的DU145单克隆细胞株。 Western blot 结果显示,pcDNA3．1-KLK7转染的DU145细胞KLK7表达量明显高于转染空载体组细胞（P＜0．01）。结论 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体的建立及稳定高表达KLK7的前列腺癌单克隆细胞株的建立,为研究KLK7在前列腺癌发生发展中的作用提供了条件。     

hPRA、hPRB真核表达载体及其转基因人子宫内膜癌细胞系的构建

目的构建人孕激素受体（hPR）亚型hPRA、hPRB真核表达载体,并以此建立表达不同hPR亚型的人子宫内膜癌细胞系。方法构建真核表达载体pcDNA3.1-hPRA、pcDNA3.1-hPRB,采用脂质体介导法转染hPR阴性的人子宫内膜癌细胞系HECCA,将HECCA分3组,前2组分别转染pcDNA3.1-hPRA、pcDNA 3.1-hPRB,同时转染两种质粒。Western blot技术检测转染细胞中hPRA、hPRB的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pcD-NA3.1-hPRA、pcDNA3.1-hPRB构建正确。pcDNA3.1-hPRA、pcDNA3.1-hPRB成功转染HECCA后,在HECCA中检测出了hPRA、hPRB表达,建立了3株转染细胞：HECCA-A只表达hPRA,HECCA-B只表达hPRB,hECCA-AB表达hPRA及hPRB。结论成功构建了hPRA、hPRB真核表达载体,载体转染后的HECCA能分别稳定表达hPRA、hPRB,建立了表达不同hPR亚型的人子宫内膜癌细胞系。