炭疽芽孢杆菌致病机制与疫苗研制策略研究进展

炭疽杆菌致病过程包括芽孢发芽、菌体繁殖和毒素分泌等多个环节。荚膜和毒素是公认的致病因子。毒素B亚单位（PA）可阻断ET、LT的致病作用，已用作疫苗，但繁殖体生长过程中产生的出血、蛋白溶解分子也是毒力分子。相应的抑制剂有治疗作用。现有炭疽粗制PA苗、芽孢苗安全有效，但仍存在不足。根据炭疽致病机制的研究进展，理想炭疽疫苗应同时靶向芽孢、荚膜和毒素及其他毒力因子等多个环节。     

定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的建立一种简便、快速、定量检测炭疽芽孢杆菌的PCR方法。方法采用TaqMan荧光探针技术,针对炭疽芽孢杆菌质粒pXO1、pXO2上的基因设计引物;用炭疽芽孢杆菌（Sterne株）污染环境土壤来模拟实际样本,比较了从土壤中提取DNA的不同方法对检测效果的影响,并与同类进口试剂进行了平行比对。结果以含有检测目的片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度可达到101拷贝/μl;用Sterne株芽孢悬液污染土壤,检测灵敏度可达2.5×103cfu/g土壤。我们研制的试剂与进口试剂在敏感性和准确性方面一致,且操作简便。结论本研究建立的炭疽芽孢杆菌实时定量PCR检测方法可特异、灵敏地检测土壤标本中可疑目标菌。     

炭疽芽孢杆菌防污染PCR-微孔板杂交-EIA检测技术的研究

目的 :建立防污染PCR_微孔板杂交_EIA检测技术 ,并用于炭疽芽孢杆菌芽孢的检测。方法 :根据炭疽芽孢杆菌毒力相关基因设计引物 ,筛选合适引物 ,建立用UDG酶防污染的PCR扩增_微孔板杂交与酶联显色检测炭疽芽孢杆菌的方法 ,并探讨试剂的室温稳定系统 ,将建立的方法用于模拟污染炭疽芽孢土壤样品的检测。结果 :根据炭疽芽孢杆菌荚膜和水肿因子基因设计的引物 ,可以同时检测两个毒力相关质粒的存在 ,用 0 .1U的UDG可以防止10 10 产物的污染 ,微孔板杂交_酶联显色检测比单纯PCR_电泳敏感 10倍。加入稳定剂的PCR_微孔板杂交_EIA体系可以耐受 7d的 37℃破坏试验。将该体系用于污染土壤的检测 ,可以检测出 0 .2 5g土壤中 10 3 个炭疽芽孢的存在。结论 :所研制的防污染PCR_微孔板杂交_EIA试剂克服了目前PCR试剂运输不便 ,产物污染所致假阳性和判定结果欠客观的缺点 ,为炭疽芽孢的快速检测提供了有力手段     

实时荧光定量PCR法检测炭疽杆菌

为建立一种简便而特异的炭疽杆菌检测方法用作临床诊断工具，以nXO1持粒上的pag基因及pXO2质粒上的cap基因为靶合成特异引物，用DNA嵌入荧光染料SYBR Green I进行定量PCR扩增，在PCR后进行熔融曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，定量PCR条件优化结果为：引物浓度0．8umol/L,Mg^2 5.0mmol/L。该法检测炭疽的灵敏度达10^3拷贝，并能区分炭疽杆菌与其他蜡样杆菌，表明实时荧光定量PCR技术能够快速准确，特异地对炭疽进行定量分析。     

利用免疫蛋白质组学鉴定炭疽杆菌蛋白MetK及其免疫原性验证

目的验证免疫蛋白质组中鉴定到的S-腺苷甲硫氨酸MetK蛋白的免疫原性。方法免疫蛋白质组学的方法鉴定到MetK蛋白,通过PCR方法扩增metK基因全长,然后将其克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌DH5α,测序正确后提取质粒转入BL21（DE3）中进行诱导表达。再通过Ni-NTA柱纯化MetK蛋白,纯化后的蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,通过多克隆抗体与炭疽芽孢杆菌A16R全菌蛋白Western印迹检测,验证MetK蛋白的免疫原性。结果与结论成功表达了MetK蛋白,制备了其多克隆抗体,为免疫蛋白质组学鉴定到的蛋白点进行验证,也为研究MetK蛋白的生物学功能研究提供了条件。     

炭疽芽孢杆菌中和性抗体的研究进展

炭疽芽孢杆菌的中和性抗体在炭疽的被动免疫和治疗中有着重要的意义。抗保护性抗原（protective antigen,PA）抗体既能够抑制芽孢出芽又具有中和毒素的作用。抗致死因子（lethal factor,LE）/水肿因子（edema factor,EF）抗体能阻断致死毒素（lethal toxin,LT）/水肿毒素（edema toxin,ET）发挥活性,荚膜抗体能结合补体导致细菌繁殖体裂解。同时中和性抗体的水平也可以作为保护性免疫的评价标准。另一方面中和性单克隆抗体可以作为分析确定PA的中和性表位的有力工具。对中和性表位的分析既有利于探索炭疽毒素致病机制,也可以为现有炭疽疫苗的使用和发展表位疫苗等新型炭疽疫苗提供理论依据。该文综述了炭疽芽孢杆菌中和性抗体的研究进展。     

艰难梭菌tcdC基因的研究进展

致病型艰难梭菌（ Clostridium difficile,CD）分泌的TcdA和TcdB毒素是主要的毒力因子,其基因表达受到致病性决定区（ pathogenicity locus,PaLoc）基因簇中多个因子调控。有研究表明,PaLoc中tcdC基因有可能编码一种对tcdA和tcdB基因表达具有负调控作用的蛋白因子,但也有研究结果与上述结论不同。关于tcdC基因功能尚存争论,其在致病过程中的作用机制仍不明确。该文主要针对艰难梭菌tcdC基因结构、功能等方面进行了综述,为进一步深入研究CD的致病机制并探索新的药物治疗靶点奠定理论基础。     

利用免疫蛋白质组学鉴定炭疽杆菌蛋白MetK及其免疫原性验证

目的验证免疫蛋白质组中鉴定到的S-腺苷甲硫氨酸MetK蛋白的免疫原性。方法免疫蛋白质组学的方法鉴定到MetK蛋白,通过PCR方法扩增metK基因全长,然后将其克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌DH5α,测序正确后提取质粒转入BL21(DE3)中进行诱导表达。再通过Ni-NTA柱纯化MetK蛋白,纯化后的蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,通过多克隆抗体与炭疽芽孢杆菌A16R全菌蛋白Western印迹检测,验证MetK蛋白的免疫原性。结果与结论成功表达了MetK蛋白,制备了其多克隆抗体,为免疫蛋白质组学鉴定到的蛋白点进行验证,也为研究MetK蛋白的生物学功能研究提供了条件。     

结核分枝杆菌特异PE/PPE蛋白家族研究进展

结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis,MTB）是结核病的病原菌。富含甘氨酸的独特蛋白质家族——PE/PPE蛋白家族编码基因约占整个MTB菌基因组的10%,该蛋白家族可能是细菌毒力和抗原变异的主要来源,对其结构和生物学功能的研究将对结核感染的血清学诊断和结核菌苗的开发具有重要意义。     

氮酮对战伤感染常见菌的体外抗菌活性研究

战伤感染是伤后常见而又十分重要的并发症,感染一旦形成,则拖延治愈时间,增加伤员痛苦,增加残废率及加重残废程度,增加治疗的复杂性和人力、物力消耗,严重感染还可造成不必要的牺牲,增加战伤死亡率。如何防止或减轻战伤感染,一直是我军广大科研人员及医务工作者研究的课题。我们在实验中发现,氮酮对引起战伤感染的常见菌,如金黄色葡萄球菌,乙型溶血性链球菌,产气荚膜杆菌,破伤风梭状芽抱杆菌等有很强的抑菌作用。现报道如下。1材料1．1菌种金黄色葡萄球菌（26112）,A族乙型溶血性链球菌（32210）,炭疽芽胞杆菌（8008）,枯…     

炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析

目的：初步分析由我国炭疽疫苗株A16R所生产的无菌培养滤液中的主要成分。方法：运用免疫蛋白质组学的手段,从炭疽A16R疫苗株无菌培养滤液的二维凝胶电泳中选择与保护性抗体结合和不与该血清结合但丰度高的蛋白质点,进行质谱鉴定和信号肽分析。结果：共选择73个点,从炭疽芽孢杆菌数据库中鉴定出66个。在66个点中,有43个点与保护性血清结合;23个为高丰度蛋白,不与该血清结合。在与保护性血清结合的43个点中,13个点为不同大小的PA分子,其中相对分子质量83×10^3和63×10^3占主导,相对分子质量较小的片段仅4个。其余成分包括炭疽表面蛋白EA1、Sap、胶原黏附蛋白、伴侣分子DnaK等。结论：我们制备的炭疽无菌培养滤液中含有PA成分,PA是炭疽疫苗的重要保护性抗原。但PA以外的其他成分在抗炭疽免疫中起何种作用,是否参与诱发机体免疫应答有待进一步研究。     

Comparison of real-time polymerase chain reaction and conventional polymerase chain reaction methods for the rapid identification of Bacillus anthracis

Bacillus anthracis spores have been shown to be one of the most effective biological weapons. For the rapid detection of B. anthracis spores, several genetic markers, including chromosomal and plasmid-based sequences, were studied with polymerase chain reaction (PCR) methods. In the present study, a method using a primer/probe set based on the pXO1-encoded pag gene for the detection of B. anthracis was tested in addition to culture. Eight pathological samples (four blood-immersed cotton specimens, two spleen tissue specimens, and two blood smears) with confirmed positive results for anthrax were used. All samples were suspended in saline solution and fixed with Gram and Giemsa stains for examination of colony and capsule formation. Amplicons were analyzed on 2% agarose gels with the classic PCR method. For real-time PCR, a fluorescently labeled TaqMan probe was used with a Smartcycler. Positive smear and cotton samples were confirmed with the standard culture and real-time PCR methods, but the same samples were found to be negative with the classic PCR method. A spleen sample known to be positive for B. anthracis was found to be negative with the culture method because of possible contamination with Proteus-type bacteria.     

炭疽芽孢杆菌蛋白质组学的研究进展

蛋白质组学是继基因组学后的一门新兴学科,可从整体水平上探究炭疽芽孢杆菌的致病机制和早期发病的标志物,在炭疽预防、诊断和治疗中具有重要的指导作用。本文综述了近年来蛋白质组学在炭疽芽孢杆菌中的应用进展。     

CDC42在HBx介导肝细胞恶性转化中作用的定量蛋白质组学研究

目的寻找在乙肝病毒 X 蛋白（HBx）诱发肝细胞恶性转化过程中 CDC42信号通路发挥作用的介导因子。方法利用基于质量亏损的准等重二甲基标记（pIDL）的定量蛋白质组学方法,检测 CDC42基因敲除前后HBx 转基因细胞蛋白质组的差异。筛选差异蛋白并对差异蛋白进行基因本体（gene ontology,GO）功能分析。结果与结论共定量到3409个蛋白,筛选出220个差异蛋白,通过 GO 分析发现与细胞骨架组织相关的 palladin、成蛋白样亚家族1（formin-like 1,FMNL1）和角蛋白-19均发生显著下调。该研究为 CDC42在 HBx 介导 Huh7细胞恶性转化的机制研究提供了候选基因和蛋白。     

Comparison of noninvasive sampling sites for early detection of Bacillus anthracis spores from rhesus monkeys after aerosol exposure

Bacillus anthracis, a spore-forming bacterium, is the etiologic agent of anthrax. B. anthracis spores can be aerosolized, are relatively easy to produce, and are capable of producing high mortality when inhaled. The prompt use of postexposure antibiotics combined with vaccination greatly increases the survival rate. Rapid detection of exposure is critical to effective case management. Using common collection swabs, culture medium, and culturing equipment, we compared six different noninvasive sampling sites to determine which might best be used to rapidly detect the presence of B. anthracis spores on rhesus monkeys after aerosolization. The results indicate that the greatest number of spores were deposited in the nares, on the face, and on the haired portions of the head, suggesting that these locations are the most effective sampling sites when attempting to detect B. anthracis aerosol exposure.     

MLVA和SNP分析在炭疽芽孢杆菌基因分型中的应用

炭疽芽孢杆菌是分子多样性较低的革兰阳性菌,具有高度基因单态性。现有的基因分型方法中仅有少数几种适用于该菌株间的基因分型研究,如多位点可变数串联重复序列分析（multiple locus variable number tandem repeat analysis,MLVA）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）分析等。该文综述了MLVA法和SNP法在炭疽芽孢杆菌菌株间分型中的应用进展。     

SELEX法筛选炭疽芽孢杆菌适配子的研究

目的：利用SELEX（system evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选,找能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的寡核苷酸适配子（aptamer),方法：体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA库,通过SELEX技术,以炭疽牙直菌疫苗株A．16R的芽孢为靶标进行15轮的筛选,利用生物素－亲和素显色系统判断寡核苷酸与牙孢的结合活性,结果：随着筛选轮数的增加,PCR扩增电泳条带渐单纯,寡核苷酸与芽孢结合后显色,D值提高9倍以上,D值随适配子结合量的增加而递增,结论：已初步筛选到与炭疽芽孢具有亲和力的适配子。