MicroRNA-320a调控唾液腺腺样囊性癌侵袭转移的实验研究

目的：探讨microRNA-320a（miR-320a）对唾液腺腺样囊性癌侵袭、转移能力的调控作用。方法：以唾液腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M为实验样品,通过脂质体介导,将miR-320a的拟似物（miR-320a mimics）转染至ACC-M细胞,升高miR-320a的表达水平。采用荧光实时定量RT-PCR检测转染前、后ACC-M中miR-320a的表达变化,通过Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力的改变,并通过细胞计数试剂盒-8检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测miR-320a对细胞凋亡的影响,Western印迹检测miR-320a的靶基因整合素β3（integrinβ3,ITGB3）的表达变化。应用SPSS13.0软件包对所得数据进行t检验或单因素方差分析。结果：转染miR-320amimics后的ACC-M中miR-320a的表达明显上调（P〈0.001）。ACC-M细胞的侵袭迁移能力显著降低（P〈0.001）,而细胞的增殖和凋亡无显著变化。Western印迹检测结果显示,Integrinβ3在低转移细胞株ACC-2表达阴性,在ACC-M中高表达;升高miR-320a在ACC-M中的表达,Integrinβ3表达明显降低。结论：低表达miR-320a有助于维持ACC的侵袭转移特性,调高其表达水平能有效抑制ACC-M的侵袭迁移能力。miR-320a可能通过调控其靶基因Integrinβ3的表达而发挥作用。     

TGF-β1信号通路相关的microRNA在唾液腺腺样囊性癌侵袭转移中的作用

目的 探讨TGF-β1/MAPKs/MMPs信号通路相关的microRNA (miRNA)在唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)侵袭、转移中的作用。方法：采用 miRNA 芯片检测TGF-β1 刺激腺样囊性癌细胞（SACC-83、SACC-LM）前、后的miRNA表达谱;对 miRNA 表达谱进行差异分析;然后挑选几个显著差异表达的miRNA,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进一步加以验证,同时运用miRNA 靶基因预测软件预测其可能调控的靶基因。结果：芯片结果显示,与低转移株SACC-83相比,高转移株SACC-LM中的miRNA上调表达40个,下调表达 101个;经TGF-β1处理后,进一步显著上调的miRNA 1个,下调12个;qRT-PCR 验证结果与 miRNAs 芯片相符。对显著差异表达的miRNAs进行靶基因预测,共筛选出与 TGF-β1/MAPKs/MMPs信号通路相关的5个miRNAs（miR-125a-5p、miR-181d、mir-145-3p、mir-126-3p和mir-320d）,其对应的靶基因有P38(MAPK14)、MMP2、ERK1/2和SMADs。结论：不同转移能力的SACC存在差异表达的 miRNAs;TGF-β1能够影响SACC细胞miRNAs 的表达;miR-125a-5p、miR-34a、mir-145-3p、mir-126-3p和mir-195可能在SACC转移相关信号调节通路TGF-β1/MAPKs/MMPs中起着重要的调控作用。     

基因表达谱芯片技术筛选涎腺腺样囊性癌转移相关基因

目的:应用基因芯片技术对口腔涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移细胞株ACC-M的基因表达谱进行对比分析。筛选差异表达基因,以期从基因水平上探讨肿瘤转移机制。方法:以涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移细胞株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型。提取mRNA,逆转录为cDNA,用Cy3和Cy5荧光染料标记,制备成cDNA探针,与表达谱芯片进行杂交扫描和分析;并应用RT-PCR技术对其中7个基因进行验证。结果:在1152个基因表达谱的筛选中,26个基因表达差异(2倍以上),其中19个基因表达水平上调,7个基因表达水平下调。RT-PCR技术对其中7个基因表达差异的验证结果与基因芯片结果一致。结论:基因芯片筛选发现其中2.3%的基因可能与涎腺腺样囊性癌细胞转移侵袭相关。     

Survivin在腺样囊性癌细胞ACC-2以及ACC-M中的表达

目的：探讨Survivin在腺样囊性癌（ACC）细胞系中的表达情况及其表达与ACC远处转移的相关性。方法：培养人涎腺腺样囊性癌（ACC-2）和肺转移腺样囊性癌（ACC-M）细胞,观察其形态学特征,采用MTr法检测细胞的生长活性,并采用SP法检测细胞中Survivin的表达。结果：ACC-2和ACC-M细胞均表现有明显的上皮样和腺样细胞的特征。ACC-M细胞的生长活性高于ACC-2细胞,且Survivin在ACC-M细胞中的表达也强于ACC-2细胞。结论：Survivin与涎腺ACC肺部转移的发生具有高度相关性。     

涎腺腺样囊性癌细胞株p16基因缺失、突变及表达意义

目的　研究 p16基因在涎腺腺样囊性癌细胞株中的缺失和突变等结构变化及其表达之间的关系。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)和 PCR-单链构象多态性 (SSCP)对涎腺腺样囊性癌细胞株 ACC- 2和高转移细胞克隆 ACC- M进行 p16基因缺失、突变的检测 ,应用免疫组化方法检测 p16基因在细胞株中的蛋白表达。结果　涎腺腺样囊性癌细胞株 ACC- 2检测 p16基因阳性 ,高转移细胞克隆 ACC- M缺失 ,两个细胞克隆均无点突变 ,ACC- 2的p16蛋白表达阳性 ,而 ACC- M蛋白表达阴性。结论　 p16基因在高转移涎腺腺样囊性癌克隆中的缺失 ,表明 p16基因在涎腺腺样囊性癌的演进和转移中具有抑癌作用。     

基质金属蛋白酶-1在人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达

目的:测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在人涎腺腺样囊性癌不同转移力细胞系中的表达。方法:以人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞系及其高转移株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型,采用免疫组化法和蛋白印迹(Western blot)法检测MMP-1的蛋白表达水平。结果:MMP-1在ACC-M细胞中的表达水平高于ACC-2细胞。结论:MMP-1在人涎腺腺样囊性癌的侵袭转移过程中可能发挥作用。     

涎腺腺样囊性癌细胞系中DNA甲基化研究

目的探讨涎腺腺样囊性癌（adenoidcysticcarcinoma，ACC）细胞系中抑癌基因甲基化状况及其与mRNA、蛋白表达之间的关系。方法甲基化特异性PCR法检测ACC细胞系ACC-2、ACC-3、ACC-M中E-钙黏着蛋白（E-cadherin，E-cad）、p16、RASSFlA、DAPK、MGMT基因启动子区的甲基化状况。应用RT-PCR方法和免疫组织化学方法检测E-cad、p16在mRNA和蛋白水平的表达。结果3个ACC细胞系中均检测到E-cad、p16基因的甲基化，而没有RASSFlA、DAPK、MGMT基因的甲基化；mRNA和蛋白水平均未检测到E-cad的表达，均检测到p16的表达。结论ACC细胞系中，E-cad、p16基因启动子区的甲基化是常见事件，甲基化可能是E-cad基因失活的主要机制之一。     

miR-181a靶向SLUG抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和迁移

目的 研究miR-181a靶向SLUG抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和迁移.方法 利用生物信息学软件预测出侵袭转移相关基因SLUG为miR-181a的候选靶基因.利用双荧光素酶报告基因检测验证miR-181a对靶基因SLUG的直接调控作用.在SACC-LM细胞中沉默SLUG后通过细胞划痕和Transwell实验检测转染后细胞侵袭迁移能力的改变.结果 生物信息学软件预测发现,SLUG mRNA序列中包含miR-181a的结合位点.双荧光素酶报告基因实验证实,与对照组相比,miR-18la mimics与psi-CHECK-2-SLUG-3' UTR共转染组细胞内荧光素酶活性明显下降(P＜0.05),而miR-18la mimics与psi-CHECK-2-SLUG-mut-3'UTR共转染组细胞内荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05),即SLUG为miR-18la的靶基因.转染SLUG siRNA可成功沉默SACC-LM细胞中内源性表达的SLUG,同时细胞的侵袭迁移能力明显下降(P＜0.05).结论 SLUG为miR-181a的靶基因.miR-181a可靶向调控SLUG,从而调控涎腺腺样囊性癌的侵袭和迁移.     

金属蛋白酶组织抑制剂对涎腺腺样嚢性癌表达β-肌营养不良蛋白聚糖的影响

目的 研究涎腺腺样囊性癌(SACC)中β-肌营养不良蛋白聚糖(β-DG)的表达情况,探讨金属蛋白酶组织抑制 剂(TIMPs)对SACC细胞表达β-DG的影响。方法 采用免疫细胞化学染色法检测经不同浓度(10、15、20、25 μmol·L-1) TIMPs作用后SACC肺高转移株ACC-M和肺低转移株ACC-2中β-DG的表达情况,以未经TIMPs作用的ACC-M和ACC-2 细胞作为对照。收集7例SACC患者的肿瘤组织样本,以10例正常涎腺组织作为对照,采用免疫组织化学染色法检 测β-DG的表达情况。结果 未经TIMPs作用前,ACC-2和ACC-M细胞均未见β-DG表达,经不同浓度TIMPs作用后, ACC-2和ACC-M细胞β-DG表达均为阳性。10例正常涎腺组织中,β-DG主要表达于腺泡的基膜上;SACC组织的癌巢周围及癌细胞中β-DG表达阴性。结论 SACC细胞外基质和细胞骨架连接处的β-DG发生了断裂,可能使其更容易发生侵袭和转移,而TIMPs能够逆转β-DG的表达,为治疗SACC提供了新思路。     

MMPs及TIMPs在ACC-M、ACC-2裸鼠移植瘤中的表达

目的:探讨唾液腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)裸鼠移植瘤中基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)及基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs)的表达。方法:采用ACC-M、ACC-2细胞株,建立ACC-M、ACC-2细胞株的裸鼠皮下移植瘤模型。在2组模型中,每组随机取3只裸鼠,用半定量RT-PCR分析移植瘤中MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2基因的表达水平,同时用免疫组化方法检测2个细胞株裸鼠移植瘤的MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达情况,检测并记录其积分光密度值。所有检测数据用SPSS11.5软件进行均数t检验处理。结果:半定量RT-PCR和免疫组化结果均显示,MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1的表达为ACC-M显著高于ACC-2(P<0.05);TIMP-2在2个细胞株裸鼠移植瘤的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1的表达差异可能与ACC-M、ACC-2转移能力的大小相关。