兔抗人ERA多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人ERA的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组MBP-hEra融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和Superose12凝胶柱过滤纯化。将纯化的MBP-hEra偶联于NHS-activatedSepharoseTM上,制备亲和层析柱,纯化兔抗人ERA多克隆抗体。结果①表达、纯化的MBP-hEra,相对分子质量(Mr)为78×103,其纯度为95％。②从抗血清中纯化获得可与MBP-hEra特异性结合的兔抗hEra多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗hEra多克隆抗体。     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素

单克隆抗体亲和层析技术可用来从体液、组织抽提液、细胞培养液中,特别是从基因工程菌体破碎液等复杂组成物中分离出微量蛋白质和多肽.由于其特异性高,操作简便而迅速,在高价值蛋白质和治疗用多肽的下游处理过程中,作为一种良好的分离纯化工具,有较广泛的适用性.本文运用该技术从人生长激素(hGH)基因工程菌发酵破碎液中一步分离制备高纯度并具有生物活性的重组hGH.     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的:制备呕吐毒素(DON)的多克隆抗体,并对抗体效价、特异性和抑制率进行鉴定。方法:采用EDC法合成了呕吐毒素的完全抗原DON-BSA,并通过免疫新西兰大白兔,得到呕吐毒素的多克隆抗体。结果:ELISA检测出多抗中含有呕吐毒素的特异性抗体,其效价最高为12800,其抑制率为50%时,DON的浓度为10mg/L,DON的最低检测浓度为0.1mg/L。与结构类似物T-2毒素和NIV的交叉率分别为9.1%和4.9%。结论:呕吐毒素经过衍生化后制备出完全抗原,经免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体可以完全满足ELISA检测的需要。     

兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定

目的 :以原核表达的人硒蛋白P片段 (HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法 :在E .coli中诱导表达HSelP片段 ,经DEAEfastflow和Ni NTA Agarose柱层析纯化后 ,以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体 ,并以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果 :成功地表达并纯化了HSelP ,制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP。结论 :以原核表达并纯化的HSelP为免疫原 ,成功地制备了兔抗该蛋白的抗体 ,Westernblot鉴定特异性良好。为进一步研究硒蛋白P的功能、分布及建立较简便的检测方法打下了基础     

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a( )/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a( )/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。     

兔抗人APE1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶多克隆抗体并进行鉴定.方法:以纯化的全长APE1蛋白为抗原, 采用改良的快速免疫法制备兔抗人APE1多克隆抗体并进行特异性亲和纯化, ELISA、Western blot和免疫组化检测制备抗体的效价和特异性.结果:ELISA检测显示该抗体的效价达到1:128 000, 相对亲和力常数为8.96×10-6 mol/L.Western blot显示该抗体能与APE1蛋白特异性结合, 免疫组化检测显示阳性反应产物主要定位于细胞核.此外, 该抗体还可用于小鼠和大鼠组织APE1蛋白的检测.结论:制备的多克隆抗体特异性和效价良好, 不仅为今后深入研究人APE1蛋白的性质与功能提供了有用的实验工具, 还可用于检测小鼠和大鼠组织中APE1蛋白的表达.     

抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定

目的激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白。结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。     

小鼠抗人BART多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗人源性BART的抗体。方法采用原核系统表达人全长BART,经纯化后免疫小鼠制备抗BART的抗体,以Western blot、免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果获得高效价的小鼠抗BART的抗体,该抗体能够识别大鼠脊髓组织中的BART分子。海马神经元和星形胶质细胞的免疫组化染色结果显示,BART分子在海马神经元、星形胶质细胞中广泛表达;在海马神经元中,BART与钙离子通道存在共定位现象。结论制备出能特异性识别天然BART分子的抗体,为检测BART分子并进一步研究其功能奠定了基础。     

抗CMTM4多克隆抗体的制备、纯化和鉴定

目的:制备抗CMTM4的多肽抗体并鉴定其性能.方法:通过TMHMM、DNAStar等软件对CMTM4的3种剪接体,CMTM4-v1,v2和v3的蛋白序列进行分析,选取了4段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联.其中第1、2、3条多肽为3种剪接体共有,混合后免疫家兔,制备Ab1;而第4条多肽为CMTM4-v1所特有,单独免疫家兔,制备Ab2.ELISA法检测抗体效价.免疫亲和层析法纯化后,进行Western blot和免疫组织化学检测,鉴定这2种抗体的特异性与适用范围.结果:得到兔抗人CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2,效价分别达1:105和1:106.纯化后的Ab1用于Western blot可特异识别超表达的CMTM4-v1和v2,并可用于免疫组织化学实验;而Ab2仅可用于Western blot,特异性识别超表达的CMTM4-v1.Ab1还可特异识别小鼠内源性Cmtm4.结论:用多肽免疫家兔制备的2种抗CMTM4抗体不仅具有较高的效价以及特异性,并且Ab1还可以特异识别小鼠Cmtm4,为CMTM4的功能研究提供了有力的支持.     

抗核糖核酸酶抑制因子抗体的制备与纯化

目的 :制备并纯化抗核糖核酸酶抑制因子 (RI)的抗体。方法 :从人胎盘中提取RI,经亲和层析纯化后免疫家兔制备RI抗体。用rProteinASepharoseFastFlow层析对抗RI抗体进行纯化 ,并用SDS PAGE、ELISA及Westernblot等进行鉴定。结果 :制备并纯化了抗RI抗体 ,经SDS PAGE分析达到了电泳纯。结论 :获得了效价高、特异性强、稳定性好的抗RI抗体 ,为对其深入研究奠定了基础     

兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法 合成特异性PIWIL 4多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔, 制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行PIWIL4的免疫组化研究.结果 通过构建P IWIL4多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体,经ELIS A 及Western blot证实兔抗人PIWIL4抗体可特异性识别PIWIL4多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在BU部分正常组织和肿瘤组织中呈阳性染色.结论 本项研究成功制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,为进一步研究PIWIL4在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

annexinA2基因片段的克隆、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法:从GenBank(BC093056.1) 中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码annexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白.表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot 鉴定.用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度.在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性.结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白.纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA 滴度达 1:640 000).CIF和 FCM 结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性.结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础.     

兔抗mLAIR-1胞外区抗体的制备、纯化和鉴定

目的:表达并纯化小鼠白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(mLAIR-1)胞膜外区与人IgGFc段的融合蛋白,制备兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体。方法:构建真核表达载体,表达并纯化mLAIR-1-Fc融合蛋白。以mLAIR-1-Fc融合蛋白免疫家兔,用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体。用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性。结果:表达并纯化了mLAIR-1-hIgFc融合蛋白。以其免疫家兔,用亲和层析的方法纯化得到兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体,能与转染细胞和细胞表面天然mLAIR-1分子结合。结论:成功地构建了mLAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体,表达并纯化了mLAIR-1-Fc融合蛋白。用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化的兔抗mLAIR-1胞外区抗体,具有高特异性和高效价,为进一步研究mLAIR-1分子的结构和功能提供了新的手段。     

RPA32蛋白原核表达、多克隆抗体制备及初步鉴定

目的原核表达人RPA32蛋白并制备其多克隆抗体,为后续RPA32的功能研究奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建原核表达质粒PET41a-RPA32,转化受体菌E.coli BL21,经IPTG诱导表达,采用GST亲和纯化方法获得GST-RPA32融合蛋白,将该融合蛋白免疫家兔制备RPA32多抗血清,最后采用Western blot检测其在多种肝细胞株中的特异性。结果在受体菌E.coli BL21中成功诱导表达GST-RPA32融合蛋白,免疫家兔后获得高效价RPA32抗血清,Western blot检测证实该血清能够识别多种肝细胞株中的RPA32及CPT作用后出现的RPA32磷酸化条带。结论成功制备兔抗人RPA32多克隆抗体,为RPA32在DNA损伤中的功能研究奠定了基础。     

Preparation and application of polyclonal antibody against a recombinant laccase

A laccase gene from Trametes sp. 420 was recombinantly expressed in Pichia pastoris, producing the enzyme rLacD. Six mutant enzymes were produced by site-directed mutation at six potential glycosylation sites in the enzyme rLacD respectively. To probe the mutants with lower activities sensitively and specifically, the antiserum containing specific polyclonal antibodies were prepared by immunizing healthy male rabbits, about 4-month-old and 2 kilogram weight, using pure rLacD as an immunogen. Antibodies were collected after the fifth immunization injection. The antiserum had titres of 1：32 in double immunodiffusion test and of 1：128,000 in enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The results obtained by Western blot analysis showed that the antiserum could react with rLacD and its mutants with highly specific and sensitive affinities.     

Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。