组织贴壁法原代培养人皮肤瘢痕成纤维细胞

目的：探索和建立可靠的人皮肤瘢痕成纤维细胞培养方法,为皮肤瘢痕体外研究提供平台。方法：采用组织块贴壁法进行瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,CO2浓度为5%,饱和湿度下培养。结果：皮肤瘢痕原代成纤维细胞培养成功,18d～20d可传第一代,以后每7d～10d可传一代,细胞形态为长梭形。结论：培养出的人皮肤瘢痕成纤维细胞可用作体外实验研究。     

人皮肤成纤维细胞原代培养方法的改良

目的：改良人皮肤成纤维细胞培养方法。方法：采用培齐后组织块消化法(简称改良法)培养成纤维细胞，以组织块贴瓶法(简称贴瓶法)作为对照。结果：改良法成功率为100％，43d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代；贴瓶法成功率为66．7％，47d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代结论：改良法是一种可行的成纤维细胞培养方法。     

人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项

0引言 成纤维细胞是皮肤组织受损后的主要修复细胞.正常情况下,其处于相对静止状态,当皮肤受损或发生某些病变时,成纤维细胞表现为增生活跃和代谢旺盛[1].近年来,国内已有一些科研单位开展皮肤成纤维细胞的培养技术,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞,从而为自体皮肤成纤维细胞的基因治疗和相关疾病的研究提供充足、可靠的靶细胞[2].国内各实验室在进行成纤维细胞原代培养时方法不一,多以组织块法和酶消化法为主.我们通过应用组织块法进行皮肤成纤维细胞原代培养而获得大量稳定细胞,并总结出皮肤成纤维细胞原代培养中组织块方法的注意事项,为今后进行细胞培养起到了一定的指导作用.     

人成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立不同组织来源成纤维细胞的培养方法并比较其培养差异。方法用消化法和贴壁法分离人胚胸主动脉成纤维细胞与人胚肺成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养的细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24 h后人胚胸主动脉成纤维细胞全部贴壁,48 h后细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而消化的人胚肺组织中细胞形态不一,经继续培养4～5代后,培养物完全由成纤维细胞构成。结论用胶原酶Ⅰ消化人胚胸主动脉成纤维细胞效果好,而用胰蛋白酶液消化人胚肺成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。     

人皮肤胶原为支架的瘢痕成纤维细胞三维培养

0引言成纤维细胞三维培养方法在有关创伤愈合及派痕研究中已被广泛采用［‘－”．既往多采用鼠尾腔可溶性胶原等，作为成纤维细胞三维培养支架．尚未见采用人皮肤胶原作支架，进行摊痕成纤维细胞三维培养的报道．我们以人皮肤胶原为支架，建立7新的疤痕成纤维细胞三维培养模型．回材料和方法1．l细胞用组织块法进行增生性癫痕组织成纤维细胞原代培养．分别用含200rnL／L和100mL／L／J’牛血清DMEM作为原代和传代后的培养液．实验用第4－－10代细胞．1．2胶原1．2．l可溶性鼠尾增胶原制备取SD大鼠尾胜剪碎，置5ml。／l一醋酸中搅拌，300…     

人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的初步研究

目的:初步探索和建立人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的方法,为盆腔器官脱垂的基础研究提供成熟的体外人盆底成纤维细胞系。方法:临床搜集因盆腔器官脱垂(POP)或非POP的良性妇科疾病而行子宫切除患者的子宫旁韧带(包括主韧带和骶韧带),组织剪碎后采用改良的Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法进行原代培养,待细胞长至贴满培养瓶底面80%以上时,消化传代,对所培养的成纤维细胞进行形态学观察及免疫荧光鉴定其来源。结果:原代培养第3-4天开始,可见有单个成纤维细胞迁出、生长,7-10d时可见少部分细胞逐渐贴壁形成较小的成纤维细胞团,第25天左右多个细胞团生长中心爬出的成纤维细胞互相连接聚集成片,铺满培养瓶底;采用免疫组化染色进行细胞鉴定,细胞波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,证实其为成纤维细胞。结论:本研究确立了体外人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养,为后续研究POP发病机制提供成熟的体外宫旁韧带成纤维细胞。     

增生性瘢痕成纤维细胞生长特性的研究

目的：研究增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长特性的差异。方法：应用消化法建立成纤维细胞系，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，应用细胞计数方法绘制细胞生长曲线，测定细胞生长速度。结果：增生性瘢痕成纤维细胞比正常皮肤成纤维细胞胞体大，形态不规则。前者细胞倍增时间约为6d，后者细胞倍增时间为3d。细胞融合后前者细胞数为后者的56％。结论：增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞是两种不同基因表现型的细胞。     

结缔组织生长因子体外促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用.方法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,分别给予不同剂量CTGF刺激(10 ng/ml),以及CTGF ASODN转染,48 h后用Western blot方法比较各组间α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达变化.结果刺激48 h后,对照组表达少量α-SMA蛋白;小剂量CTGF刺激组和大剂量CTGF 刺激组作用48 h后,α-SMA表达量均显著增多,且成浓度依赖性变化(P<0.01);而CTGF ASODN转染组α-SMA蛋白表达与对照组比较明显减少(P<0.05).结论 CTGF在体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞(myofibroblast ,MyoF)的转分化,阻断或者抑制其表达可能将更有效的治疗瘢痕挛缩.     

正常人皮肤成纤维细胞不同培养条件下的生物学特性

目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长,增殖,代谢及蛋白质合成等情况,探讨成纤维细胞的最佳培养模型。方法 将正常皮肤中的成纤维细胞（NsFb）分离出来并进行原代及继代培养,之后建立不同的成纤维细胞培养系统,分别利用绘制细胞生长曲线,^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR）掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA代谢及胶原合成等情况,研究细胞在不同条件下的生物学特性。结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖,代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于两种胶原凝胶中培养时的情况。结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性。     

胆汁酸对人肝内胆管瘢痕成纤维细胞生长的影响

目的：探讨胆汁酸对人肝内胆管瘢痕成纤维细胞生长的影响。方法原代培养人肝内胆管瘢痕组织成纤维细胞。倒置显微镜下观察细胞生长的形态变化,采用噻唑蓝（ MTT ）法、细胞计数细胞和划痕实验检测胆汁酸对瘢痕成纤维细胞生长的影响。结果（1）成功原代培养人肝内胆管瘢痕成纤维细胞。（2） MTT显示在72 h,浓度0.5、1.0、2.5、5μmol／L的胆酸（CA）和脱氧胆酸（DCA）促进瘢痕成纤维细胞活力（P＜0.05）,其他胆汁酸对瘢痕成纤维细胞的生长无明显影响（P＞0.05）;浓度在10、20、50、100、250、500μmol／L,游离胆汁酸和结合胆汁酸抑制瘢痕成纤维细胞的活力（P＜0.05）。同时,单独使用CA（2．5μmol／L）或DCA（5μmol／L）或联合使用CA （2．5μmol／L）和DCA（5μmol／L）,与未添加胆汁酸比较,细胞数量、活力明显增加,愈合距离明显缩小（P＜0.05）;联合使用与单独使用比较,细胞数量、活力和愈合距离差异无统计学意义（P＞0.05）。结论游离胆汁酸（ CA、DCA）在肝内胆管瘢痕的形成过程中可能扮演重要角色。     

青蒿素对体外瘢痕成纤维细胞的生物学影响

目的 观察青蒿素对体外培养的瘢痕成纤维细胞的生物学影响，以探讨将其应用于瘢痕防治的可能性。方法 将不同浓度的青蒿素作用于体外培养的瘢痕成纤维细胞，在不同时相点观察青蒿素对瘢痕成纤维细胞生物学特性的影响。结果 青蒿素在30—120mg/L浓度范围内，可剂量及时间依赖性地抑制瘢痕成纤维细胞的增殖活性及胶原合成量；光镜下见用药组细胞呈椭圆性，胞浆颗粒增多，甚至核浓缩、核碎裂。结论 青蒿素对瘢痕的预防和治疗有实用前景。     

人瘢痕成纤维细胞中Sp-1等转录因子的研究

目的 :研究增生性瘢痕成纤维细胞中纤维化相关的转录因子。方法 :人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞原代、传代培养后抽提核蛋白。人工法合成转录因子Sp 1、NF Ⅰ、NF κB识别序列的双链寡核苷酸 ,并采用Dig ddUTP 3′末端标记该双链寡核苷酸。电泳迁移率改变实验 (EMSA)法研究瘢痕成纤维细胞中纤维化相关的Sp 1、NF Ⅰ、NF κB等转录因子。结果 :在人增生性瘢痕成纤维细胞的核蛋白中存有纤维化相关的Sp 1、NF Ⅰ、NF κB等转录因子。结论 :瘢痕纤维化的发生、发展与纤维化相关的转录因子Sp 1、NF Ⅰ、NF κB密切相关。     

人角质形成细胞体外分离与无血清培养的实验研究

目的探讨一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法,为角质细胞的多方面研究提供细胞来源。方法采取两步消化法对皮肤进行消化以获取角质形成细胞,采用无血清培养技术进行角质细胞的体外培养,进行细胞形态学观察以及生长曲线的绘制与分析。结果分离酶和胰蛋白酶联合两步消化法能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,培养后细胞融合时间短,同时又能够避免成纤维细胞的污染,可获取较多高纯度的角质形成细胞。角质细胞无血清培养可以在体外快速稳定增殖,并在多次传代后保持了正常形态。结论两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

瘢痕表皮细胞的培养及电镜观察

目的：揭示瘢痕表皮细胞的生物特性及其对瘢痕发生、发展的影响。方法：（１）用低倍透射电镜对增生性产痕及正常皮肤的表面进行对比观察。（２）对增生性瘢痕的表皮进行培养。（２）用原位包埋及离心团块两种方法对培养的颜痕表皮细胞进行透射电镜观察。结果：（１）增生性瘢痕表皮的细胞导人及细胞器交正常皮肤表皮的少。（２）培养的瘢痕表皮民正常皮肤的表皮细胞在细胞结构及生长特性上无明显差异。（３（原位包埋法较离心法技术     

汉防抑制甲素对瘢痕成纤维细胞增殖作用的影响的实验研究

目的比较汉防抑制甲素与激素对瘢痕成纤维细胞增殖作用的差异,为汉防抑制甲素应用于临床提供依据。方法利用瘢痕成纤维细胞体外培养模型,采用MTT记数、流式细胞仪记数厦HE染色法,比较并分析了汉防抑制甲素与激素对瘢痕成纤维细胞增殖活力的影响。结果同在IC50时,两者对瘢痕成纤维细胞的抑制作用相似。均可使生长曲线压低,群体倍增时间延长,G2-M期细胞明显增多厦时相时间明显延长,此外汉防抑制甲素还可使S期明显延长。结论汉防抑制甲素具有与糖皮质激素相似的抑制瘢痕成纤维细胞增殖的作用。