血管紧张素Ⅱ对大鼠血管平滑肌细胞T型钙通道及其信号转导通路的影响

目的 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞Cav3.1表达的影响及其作用机制.方法 酶消化法原代培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,应用第5代传代细胞,实验随机分为7组:对照组(不加任何药物)、AngⅡ组[加入AngⅡ(0.1μmol/L)培养24 h]、AngⅡ+氯沙坦钾组[加入氯沙坦钾(1μmol/L)培养1h,再加入AngⅡ(0.1 μmol/L)共同培养24 h]、AngⅡ+PD98059组[加入PD98059(10 μmol/L)预刺激1h,再加入AngⅡ(0.1 μmol/L)共同培养24 h]、PD98059组[加入PD98059(10 μmol/L)培养1h]、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组[先加入氯沙坦钾(1μmol/L),PD98059(10 μmol/L)培养1h,再加入AngⅡ(0.1 μmol/L)共同培养24 h]、氯沙坦钾组[加入氯沙坦钾(1μmol/L)培养4h].RT-PCR、Western blot方法测定各组T型钙通道的表达.结果 PCR结果显示:与对照组(1.000±0.315)比较,AngⅡ组Cav3.1表达量(17.930±0.954)明显增加(P＜0.01);PD98059组、氯沙坦钾组Cav3.1表达量为0.928±0.262、0.978±0.292,与对照组比较差异无统计学意义(P＞ 0.05);AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+PD98059组、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组的Cav3.1表达量分别为0.125±0.007、0.066±0.015、0.109±0.018,明显低于AngⅡ组(P＜0.01).Western blot结果显示:与对照组比较,AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+PD98059组及AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组Cav3.1蛋白表达明显降低(P＜0.05);而PD98059组及氯沙坦钾组Cav3.1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AngⅡ通过Ras/PKCξ/MEK/ERK 1/2路径增加血管平滑肌细胞Cav3.1的表达.     

NAD对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的 探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的作用.方法 提取新生Wistar大乳鼠原代心肌成纤维细胞,传代培养,采用2～4代细胞.实验分为空白对照组,AngⅡ(0.01、0.1、1μmol/L)组,NAD(250 μmol/L)组,AngⅡ(1 μmol/L)+NAD (250 μmol/L)组,FAM组,Sirt1-siRNA+AngⅡ(1μmol/L)组,Sirt1-siRNA组,Sirt1-siRNA+NAD(250 μmol/L)组,Sirt1-siRNA十Ang Ⅱ(1 mol/L)+ NAD(250 μmol/L)组.刺激24h后,提取总RNA,Real time RT-PCR法分别检测SIRT1和Ⅰ型胶原mRNA的表达.结果 心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达随着AngⅡ浓度升高明显增加(P＜0.05),呈浓度依赖性.与空白对照组比较,NAD(250 μmol/L)组SIRT1 mRNA表达增高(P＜0.05).与AngⅡ(1μmol/L)组比较,AngⅡ(1μmol/L)+NAD(250μmol/L)组Ⅰ型胶原mRNA的表达明显减少(P＜0.01).相对于FAM组,Sirt1-siRNA转染后各组SIRT1 mRNA的表达减少(P＜0.05),而心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达增多(P＜0.05).结论 NAD可以抑制心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达,SIRT1影响Ⅰ型胶原mRNA的表达,它们对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化有保护作用.     

姜黄素和氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的内皮间质细胞转化的作用及机制研究

目的 研究姜黄素和氯沙坦对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的内皮间质细胞转化(EndMT)的作用及机制.方法 培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)然后分为4组:对照组(不加刺激药物的正常培养组);AngⅡ组(加入刺激浓度为0.1 μmol/L或1μmol/L的AngⅡ);姜黄素+AngⅡ组(先加入12.5 μmol/L的姜黄素预孵1h,再加入1 μmol/L的AngⅡ);氯沙坦+AngⅡ组(先加入10 μmol/L的氯沙坦孵育2h,再加入1μmol/L的AngⅡ);刺激24 h后行划痕试验检测各组细胞迁移能力改变和CCK-8检测细胞活力;刺激5d后,显微镜观察各组细胞形态变化和Western blot检测各组血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白表达量.结果 HUVECs经AngⅡ刺激后形态改变,长梭形样细胞明显增多;姜黄素和氯沙坦可维持内皮细胞铺路石样形态.AngⅡ呈浓度依赖性地降低HUVECs存活率(P＜0.01);各组存活率均＞50％(均P＜0.05).相比对照组,AngⅡ促进HUVECs的迁移(P＜0.05);相比AngⅡ组,加入姜黄素和氯沙坦可抑制HUVECs的迁移(均P＜0.05).AngⅡ可诱导EndMT,AngⅡ刺激5d后VE-cadherin表达减弱(P=0.003),而α-SMA和TGF-B1的表达都明显增强(均P＜0.01),姜黄素和氯沙坦使VE-cadherin表达明显增加,而α-SMA和TGF-β1的表达均明显下调.结论 姜黄素和氯沙坦通过下调TGF-β1表达抑制AngⅡ诱导的EndMT.     

促红细胞生成素对血管紧张素Ⅱ诱导的系膜细胞增殖及Ⅰ/Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白表达的影响研究

目的 探讨促红细胞生成素（EPO）对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导的系膜细胞增殖及Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）和纤维连接蛋白（FN）表达的影响。方法 将体外培养大鼠肾小球系膜细胞分为4组：对照组,AngⅡ组（0.1、1.0、10.0 μmol/L）,EPO组（1、10、100 U/L）,AngⅡ+EPO组（EPO 1、10、100 U/L预处理1 h后加AngⅡ 1.0 μmol/L）。各组处理0、24、48 h时,CCK-8法检测系膜细胞增殖情况,免疫印迹法检测系膜细胞ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表达水平,ELISA法检测系膜细胞培养上清液中ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白水平。结果 单独给予AngⅡ或EPO均可刺激系膜细胞增殖,AngⅡ组亚组和EPO组亚组24、48 h时系膜细胞增殖水平均高于对照组,且48 h时高于24 h时,24 h时高于0 h时,差异均有统计学意义（P＜0.05）;单独给予AngⅡ或EPO均可促进系膜细胞合成及分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN,除EPO 1 U/L亚组Col Ⅰ蛋白表达水平与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）外,AngⅡ组亚组和EPO组其他亚组ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表达水平均高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。与AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 1 U/L亚组比较,AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 10 U/L亚组和AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 100 U/L亚组在24、48 h时系膜细胞增殖水平及ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,但与对照组及同浓度单纯EPO亚组比较,AngⅡ1.0 μmol/L+EPO组各亚组24、48 h时系膜细胞增殖水平及ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表达水平均增高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 Ang Ⅱ能刺激系膜细胞增殖,促进系膜细胞合成及分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN,EPO亦有一定程度类似作用,但两者同时存在时,EPO可拮抗AngⅡ诱导的系膜细胞增殖及ColⅠ、Col Ⅳ和FN的合成及分泌,提示EPO除可纠正肾性贫血外,可能对AngⅡ诱导的肾小球硬化具有抑制作用而保护肾功能。     

血管紧张素Ⅱ通过p38丝裂原蛋白激酶信号通路诱导巨噬细胞骨调素基因的上调表达

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激巨噬细胞骨调素(OPN)基因表达的模式变化,及p38丝裂原蛋白激酶(p38MAPK)信号通路在AngⅡ上调表达骨调素中的作用。方法 用反转录聚合酶反应(RT-PCR)测定AngⅡ体外刺激RAW264.7细胞骨调素基因表达及p38MAPK特异抑制剂SB202190的影响;用Western印迹测定Ang Ⅱ(1 μmol/L)诱导RAW264.7细胞p38MAPK及其转录因子-激活转录因子2(ATF2)表达的时间模式及SB202190对AngⅡ(1 μmol/L)诱导RAW264.7细胞p38MAPK磷酸化表达的影响。结果 (1)AngⅡ(1 μmol/L)诱导RAW264.7细胞骨调素基因表达呈时间依赖性,3 h骨调素表达略有升高,6、12、24 h骨调素分别升高0.9、2.3及2.4倍(P<0.01);而24 h阴性对照无明显变化,说明骨调素的表达呈诱导分泌性。(2)AngⅡ诱导RAW264.7细胞骨调素基因表达呈剂量依赖性,AngⅡ(1 μmol/L)孵育12 h即可诱导骨调素显著表达,升高2.6倍(P<0.01)。(3)SB202190(5 μmoL/L)在AngⅡ(1 μmol/L)刺激前30 min加入培养基抑制作用最明显,共同孵育12 h,抑制率达到61.7％(P<0.01);而同时和刺激后120 min加入SB202190(5 μmol/L),抑制作用不明显,抑制率分别为20.9％和20.1％。(4)不同浓度SB202190 1、5、10 μmol/L在AngⅡ(1μmol/L)刺激前30 min加入培养基,共同孵育12 h,其抑     

吡哆胺和替米沙坦对血管紧张素II诱导的大鼠心肌细胞氧化应激的影响

 目的 探讨吡哆胺和替米沙坦对血管紧张素II诱导的大鼠心肌细胞氧化应激的影响。方法 大鼠心肌细胞培养并随机分为正常对照组【C组】,血管紧张素Ⅱ组【10-6mol/L,AngⅡ组】,吡哆胺组【吡哆胺（10 mmol/L）+ AngⅡ（ 10-6mol/L）,P组】,替米沙坦组【替米沙坦（10-6mol/L）+ AngⅡ （10-6mol/L）,T组】,联合治疗组【替米沙坦（10-6mol/L)＋吡哆胺（10 mmol/L）+ AngⅡ（ 10-6mol/L）,TP组】。 流式细胞仪检测细胞上清液中的活性氧簇（ROS）浓度,硫代巴比妥酸法（TBA）测定丙二醛（MDA）浓度,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶（SOD）活力,荧光实时定量PCR方法检测心肌细胞所表达的晚期糖基化终产物受体（RAGE）mRNA表达量。 结果 与AngⅡ组比较,T组、P组及TP组MDA、ROS浓度均显著降低、SOD活力显著升高（P<0.05）;与T组比较,P组、TP组的ROS浓度明显降低、SOD活力明显升高（P<0.05）;与AngⅡ组比较,T组、P组和TP组RAGE mRNA表达量明显降低（P<0.01）;与T组、P组比较,TP组的RAGE mRNA表达进一步降低（P<0.05）。结论 吡哆胺和替米沙坦协同下调大鼠心肌细胞RAGE mRNA的表达,二者均可改善氧化应激,但吡哆胺较替米沙坦强。     

RhoA-ROCK通路在血管紧张素Ⅱ刺激人胚肺成纤维细胞表达结缔组织生长因子中的作用

目的 探讨RhoA-ROCK通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激人胚肺成纤维细胞(HFL-1)表达结缔组织生长因子(CTGF)中的作用.方法 培养HFL-1,设置无刺激对照组、AngⅡ组(10-7 mol/L的AngⅡ刺激)、Irbesartan+AngⅡ组(以10-6 mol/L的AT-1受体拮抗剂Irbesartan预处理1 h后再予10-7 mol/L的AngⅡ刺激)和ROCK抑制剂Y27632+AngⅡ组(10-6 mol/L的Y27632预处理1 h后再予10-7 mol/L的AngⅡ刺激).利用Western印迹和QuantiGene多基因定量方法检测RhoA-ROCK激活及下游因子CTGF表达情况.结果 观察Irbesartan对AngⅡ诱导CTGF蛋白表达的实验,结果:AngⅡ组CTGF蛋白表达较对照组增强(0.89±0.05比0.48±0.10,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(0.72±0.05)较AngⅡ组减弱(P＜0.05).AngⅡ组RhoA蛋白表达较对照组增强(3.40±0.46比1.77±0.37,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(2.27±0.45)较AngⅡ组减弱(P＜0.05).重新培养细胞留取标本观察Y27632对AngⅡ诱导CTGF蛋白表达的影响,结果:AngⅡ组CTGF蛋白表达较对照组增强(0.62±0.15比0.16±0.05,P＜0.01),Y27632+AngⅡ组(0.17±0.04)较AngⅡ组减弱(P＜0.01).从基因水平重复上述实验,结果:AngⅡ组CTGF mRNA表达较对照组增强(1.16±0.06比1.00±0.01,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(0.99±0.07)较AngⅡ组减弱(P＜0.01),Y27632+AngⅡ组(1.04±0.08)较AngⅡ组减弱(P＜0.05);AngⅡ组RhoA mRNA表达较对照组增强(1.21±0.07比1.00±0.06,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(1.00±0.12)较AngⅡ组减弱(P＜0.05),Y27632+AngⅡ组(1.10±0.05)与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AngⅡ通过AT-1受体诱导HFL-1细胞CTGF蛋白和mRNA表达,RhoA-Rock通路参与其中.

Abstract：

Objective To explore the production of connective tissue growth factor(CTGF)by Angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ)in human embryonic lung fibroblast via the RhoA-ROCK pathway. Methods Human embryonic lung fibroblast(HFL-1)was divided into 4 groups:(1)control group:no stimulation;(2)AngⅡgroup:stimulation of AngⅡ(10-7 mol/L);(3)Irbesartan plus Ang Ⅱ group:stimulation by Ang Ⅱ(10-7 mol/L)with AT-1 receptor antagonist irbesartan(10-6 mol/L)pre-treatment;(4)Irbesartan plus Ang Ⅱ group:stimulation by Ang Ⅱ(10-7 mol/L)with ROCK inhibitor Y27632(10-6 mol/L)pretreatment.Then the products of protein and RNA were collected.Western blot and QuantiGene were used to detect the activation of RhoA-Rock pathway and CTGF.Results Exploring the affect of irbesartan on Ang Ⅱ through the Western blot analysis of CTGF and RhoA protein expression:the CTGF level was up-regulated by AngⅡ(0.89±0.05 vs control 0.48 ±0.10,P ＜0.01).Such an effect was markedly blocked by a pretreatment of irbesartan(0.72 ± 0.05,P＜0.05).After the use of Ang Ⅱ,the expression of RhoA protein was significantly enhanced(3.40 ± 0.46 vs control 1.77 ± 0.37,P＜0.01)and blunted by a pretreatment of irbesartan(2.27 ± 0.45,P＜0.05).The Western blot analysis of CTGF protein expression showed that Ang Ⅱ caused a robust increase in CTGF(0.62 ± 0.15 vs control 0.16 ± 0.05,P＜0.01).Such an effect was markedly blocked by a pretreatment of Y27632(0.17 ± 0.04,P＜0.01).The result was similar at the gene level.Ang Ⅱ significantly increased the expression of CTGF mRNA(1.16 ± 0.06 vs control 1.00 ± 0.01,P＜0.01).And it was markedly blocked by a pretreatment of irbesartan(0.99 ±0.07,P＜0.01)or Y27632(1.04 ±0.08,P＜0.05).AngⅡ significantly increased the expression of RhoA mRNA(1.21 ± 0.07 vs control 1.00 ± 0.06,P＜0.01).And it was markedly blocked by a pretreatment of irbesartan(1.00 ± 0.12,P＜0.05)but not Y27632(1.10 ± 0.05,P＞0.05).Conclusion Ang Ⅱ activates HFL-1 to produce CTGF through the AT-1 receptor.And the RhoA-Rock pathway is involved.     

砷暴露及雌激素受体拮抗剂对雌、雄胎鼠AECⅡ内ERβ表达的影响

目的 观察砷暴露及雌激素受体拮抗剂（ICI182,780）对雌、雄胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）内雌激素受体β（ERβ）表达的影响。方法 孕19~20 d ICR小鼠剖腹取胎鼠,分离、纯化雌性组和雄性组胎鼠AECⅡ。四甲基亚唑蓝（MTT）法确定亚砷酸钠(NaAsO₂）染毒AECⅡ细胞的剂量。将AECⅡ细胞分为以不同剂量（低、中、高）NaAsO₂染毒的砷暴露组,培养24 h;另取AECⅡ细胞为联合暴露组,分别加入二甲基亚砜（DMSO）（溶剂对照组）、NaAsO₂ 5 μmol/L（单独砷染毒组）、NaAsO₂（5 μmol/L）+ICI182,780（1×10-4 mol/L）（砷+拮抗剂组）,培养24 h;均设空白对照组（不加任何试剂）。24 h后,砷暴露组行流式细胞术测凋亡率,砷暴露组、联合暴露组行实时荧光定量PCR法和Western blot检测胎鼠AECⅡ内ERβ mRNA和蛋白的表达水平。结果 AECⅡ纯度达（87.0±2.5）%。MTT法将0.5（低）、1.25（中）、5（高） μmol/L的浓度设置为染毒剂量。砷暴露组中:雌、雄中、高剂量组细胞凋亡率均高于空白对照组（P<0.05）,而雌、雄各剂量组间比较差异无统计学意义。雌性中、高剂量组ERβ mRNA和蛋白表达水平高于空白对照组（P<0.05）和同剂量组雄性（P<0.05）;雄性各剂量组ERβ mRNA和蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义。联合暴露组中:雌性单独砷染毒组ERβ mRNA和蛋白表达水平高于砷+拮抗剂组（P<0.01）及同剂量组雄性（P<0.05）,且高于空白对照组和溶剂对照组（P<0.05）,雄性各组间比较差异无统计学意义;雌、雄其余各组间比较差异无统计学意义。结论 砷暴露可使雌性胎鼠AECⅡ内ERβ表达上调且高于雄性,此过程可被雌激素受体拮抗剂阻断。     

齐拉西酮对脂多糖损伤海马神经干细胞的保护作用

目的 探讨齐拉西酮对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）损伤后海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）活性的作用及其凋亡的影响.方法 建立体外大鼠海马NSCs的LPS损伤细胞模型,分为对照组（sham组）、LPS组、LPS＋齐拉西酮组（包括1μmol/L、5μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L等4个不同剂量组）,药物作用48 h或72 h后,采用WST-1试剂检测细胞活性,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测乳酸脱氢酶释放情况,并采用流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果 （1）细胞活力：作用48 h后,与对照组（吸光度值0.380±0.029）相比,LPS组（吸光度值0.265±0.047）细胞活力显著下降（P＜0.01）,而LPS＋齐拉西酮5μmol/L组（吸光度值0.316±0.008）组与LPS＋齐拉西酮10 μmol/L组（吸光度值0.321±0.006）则显著提升其活力（与LPS相比较,均P＜0.05）.作用72 h后的细胞活力结果与48 h相似,LPS组细胞活力显著低于对照组（P＜0.01）,而LPS＋齐拉西酮5μmol/L组与LPS＋齐拉西酮10μmol/L组则缓解了LPS对其活力的抑制.（2）LDH检测结果显示,作用48 h或72 h后,LPS组LDH的释放水平显著高于sham组（均P＜0.01）,而LPS＋齐拉西酮5μmol/L组与LPS＋齐拉西酮10 μmol/L组的LDH释放水平均显著低于LPS组（均P＜0.01）.（3）流式细胞术检测凋亡的结果显示,作用48 h后,与对照组[（9.15±1.54）％]相比,LPS组[（22.67±2.15）％]凋亡百分率显著上升（P＜0.01）,而LPS＋齐拉西酮5μmol/L组[（18.45±3.84）％]组与LPS＋齐拉西酮10 μmol/L组[（17.87±2.29）％]则显著抑制其凋亡（与LPS相比较,均P＜0.05）.作用72 h后,LPS组的凋亡百分率[（15.70±2.97）％]仍然显著高于对照组[（8.45±1.04）％],而LPS＋齐拉西酮10 μmol/L组[（10.52±1.42）％]则显著低于LPS组（P＜0.05）.结论 适当浓度的齐拉西酮能抑制LPS导致的海马NSCs损伤,这一作用可能是其发挥神经保护效应的细胞学基础之一.     

瘦素对大鼠肝纤维化星状细胞的作用及相关ERK信号转导机制

目的：探讨瘦素（leptin）对大鼠肝纤维化星状细胞（HSC）的作用及相关信号转导机制。方法采用改良原位灌注、Optiprep密度梯度离心法分离纯化大鼠HSC。通过台盼蓝拒染试验评估细胞存活率,α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）免疫组化鉴定,光镜观察形态学变化。将40只SD大鼠分为4个处理组：对照组、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）组（加入10-7mol/L AngⅡ）、Leptin组（加入100ng/ml Leptin）、Leptin＋AngⅡ组（加入100ng/ml Leptin＋10-7mol/L AngⅡ）。分别采用3H- TdR和3H- Pro掺入法进行HSC增殖和胶原合成的测定。Western blot检测各处理组p- ERK1/ERK1、p- ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表达情况。结果大鼠HSC存活率＞90%,传代1次后HSC纯度＞95%。与对照组相比,AngⅡ组、Leptin组、Leptin＋AngⅡ组的HSC增殖和胶原合成均明显增加（均P＜0.05）;与AngⅡ组、Leptin组相比,Leptin＋AngⅡ组HSC增殖和胶原合成明显增加（均P＜0.05）。Western blot显示,AngⅡ组、Leptin组、Leptin＋AngⅡ组的p- ERK1/ERK1、p- ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平均较对照组明显升高（均P＜0.05）;与AngⅡ组、Lep-tin组相比,Leptin＋AngⅡ组p- ERK1/ERK1、p- ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平明显升高（均P＜0.05）。结论瘦素可通过上调AngⅡ水平,激活ERK信号转导通路,刺激HSC增殖和胶原合成,导致肝纤维化。     

肼苯哒嗪对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231雌激素受体α去甲基化的影响

目的探讨肼苯哒嗪对雌激素受体（ER）α阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231ERα基因启动子区CpG岛DNA甲基化的影响。方法体外细胞培养,按药物浓度分为4组：分别用0、5、10、20μmol／L的肼苯哒嗪作用ERa阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231细胞96h;按药物作用时间分为4组：分别于0、72、96、120h10μmol／L肼苯哒嗪作用ERn阴性人乳腺癌细胞株MDA—MB-231细胞,倒置光学显微镜下观察肼苯哒嗪对细胞生长的影响。各组提取MDA—MB-231细胞总RNA,用RT-PCR及图像分析检测肼苯哒嗪对MDA—MB-231细胞ERamRNA表达的影响;提取MDA—MB-231细胞基因组DNA,纯化、修饰后用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231ERa基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态。结果与对照组比较,5、10、20μmol／L肼苯哒嗪组ER／β-actin光密度积分值比值均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）;72、96、120h10μmol／L肼苯哒嗪组ER／β-actin光密度积分值比值均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。5μmol／L肼苯哒嗪作用120h后ERa基因呈部分去甲基化状态,而经10μmol／L肼苯哒嗪作用120h后的ERα基因呈完全去甲基化状态。结论肼苯哒嗪可以逆转ERα阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231ERα基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态,使沉默基因重新表达。     

姜黄素对氧化型低密度脂蛋白诱导的大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1表达、细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1表达、增殖和凋亡的影响。方法分离SD大鼠血管平滑肌细胞进行培养传代,采用不同浓度的姜黄素作用于氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导的大鼠平滑肌细胞,根据作用药物浓度进行分组,对照组（不加任何药物）,Ox-LDL 100μg/mL组,Ox-LDL 100μg/mL＋姜黄素20μmol/L组,Ox-LDL 100μg/mL＋姜黄素40μmol/L组,Ox-LDL 100μg/mL＋姜黄素80μmol/L组。分析姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达、对细胞的增殖的影响。按照加入药物浓度进行分组,对照组（不加任何药物）,姜黄素50μmol/L组,姜黄素100μmol/L组,姜黄素120μmol/L组,分析姜黄素对细胞凋亡的影响。结果 Ox-LDL 100μg/mL组MCP-1分泌[（812.6±78.7）ng/L]及MCP-1 mRNA表达水平[（1.18±0.11）]较对照组[（91.3±6.1）ng/L,（0.16±0.04）]显著升高,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。姜黄素对OxLDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表达、细胞增殖具有显著的抑制作用,对细胞凋亡有诱导作用,并且随着姜黄素浓度的增加,作用越明显（P〈0.01）。结论姜黄素能够抑制Ox-LDL诱导的大鼠细胞平滑肌细胞MCP-1表达以及细胞增殖,诱导大鼠细胞平滑肌细胞凋亡。     

氧化苦参碱对脂多糖诱导的RAW264.7细胞一氧化氮及其诱导型合酶表达的影响

目的：观察氧化苦参碱（OMT））对脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7细胞一氧化氮（NO）释放量及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：采用LPS诱导RAW 264.7细胞建立细胞炎症反应模型。实验分组：空白对照组、LPS组（1μg/mL）、OMT组（100μmol/L）、LPS＋OMT小剂量组（20μmol/L）、LPS＋OMT中剂量组（50μmol/L）、LPS＋OMT大剂量组（100μmol/L）。采用Griess试剂法测定细胞培养液中NO释放量。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法测定RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达。结果：OMT显著减少LPS诱导的RAW 264.7细胞NO的释放（P〈0.05,P〈0.01）;同时减少LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达（P〈0.05,P〈0.01）。结论：OMT可能通过抑制LPS诱导的巨噬细胞iNOS mRNA表达,减少NO的释放量而发挥抗炎作用。     

小檗碱通过ERK,JNK信号转导途径对COX-2的抑制作用

目的：研究中药小檗碱是否通过ERK,JNK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.方法：取人外周静脉血分离及培养单核细胞,分为对照组、LPS组、LPS＋小檗碱25μmol/L组、LPS＋小檗碱50μmol/L组、LPS＋小檗碱100μmol/L组.分别在培养后30min,6,12,24h提取细胞,行RT-PCR法测定COX-2mRNA水平,行Western Blot法测定ERK,p-ERK,JNK,p-JNK及COX-2蛋白水平.同时加入选择性ERK,JNK抑制剂,分别测定COX-2mRNA及蛋白水平.结果：与LPS组相比,小檗碱组COX-2mRNA及蛋白表达明显抑制（P〈0.05）.与LPS组相比,小檗碱组ERK活性水平有统计学差异（P〈0.05）.但是与LPS组相比,低、中浓度小檗碱组（25,50μmol/L）JNK活性水平无统计学差异,高浓度小檗碱组（100μmol/L）JNK活性水平有明显统计学差异（P〈0.05）.加入ERK,JNK抑制剂之后,COX-2mRNA及蛋白水平降低明显（P〈0.05）.结论：小檗碱能抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白水平,其作用程度呈浓度依赖性.小檗碱可能通过ERK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.高浓度小檗碱可能通过JNK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.     

佛波酯慢性处理对大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C表达的影响

目的观察佛波酯（PMA）慢性处理大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C（PKCs）表达的影响。方法原代培养大鼠m管平滑肌细胞,①按照PMA处理浓度将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMAI、5、10μmol／L组,各组细胞均处理4h;②按照PMA处理时间将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMA1、4和24h组,PMA组的药物浓度均为10μmol／L。采用Western blotting技术榆测各亚型PKCs蛋白的表达。结果PMA浓度〈10μmol／L处理细胞时间〈4h不影响PKC—α的表达（P〉0．05）,10pmlol／LPMA处理24h能抑制PKC—α的表达（P〈0．05）;PMA浓度〉5μmol／L处理细胞时间〉4h可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）,PMA浓度〈5μmlol／L处理细胞时间〈4h对PKC-δ的表达无显著影响（P〉0．05）,10μmol／LPMA处理细胞1h即可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）;PMA浓度〉5pμmol／L处理细胞时间〉4h可以明显抑制PKC-θ的表达（P〈0．01）;10μmol／L的PMA处理细胞24h对PKC．∈的表达无明显影响（P〉0．05）。结论PMA慢性处理大鼠血管平滑肌细胞可抑制传统型PKC—α和新型PKC-δ、ε、θ的表达,对非典型PKC-ζ的表达没有影响。     

己酮可可碱联合霉酚酸酯对高糖诱导人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1和纤维连接蛋白表达的影响

目的探讨高糖对人肾小球系膜细胞（human mesangial cells,HMCs）单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoat-tractant protein-1,MCP-1）及细胞外基质的主要成分（extracellular matrix,ECM）纤维连接蛋白（fibronectin,FN）表达的影响及己酮可可碱（pentoxifylline,PTX）联合霉酚酸酯（mycophenolate,MMF）对上述指标的干预作用。方法将培养的HMCs分为8组：正常对照组（NG,5 mmol/L葡萄糖）;高糖组（HG,30 mmol/L葡萄糖）;甘露醇渗透压对照组（Man,5 mmol/L葡萄糖＋25 mmol/L甘露醇）;高糖＋PTX-0.03组（P1,30 mmol/L葡萄糖＋0.03 mg/mL PTX）;高糖＋PTX-0.3组（P2,30 mmol/L葡萄糖＋0.3 mg/mL PTX）;高糖＋MMF-10组（M1,30 mmol/L葡萄糖＋10μg/mLMMF）;高糖＋MMF-100组（M2,30 mmol/L葡萄糖＋100μg/mL MMF）;高糖＋PTX＋MMF组（P＋M,30 mmol/L葡萄糖＋0.3 mg/mL PTX＋100μg/mL MMF）,分别在24、48、72 h采用RT-PCR法和ELISA法检测PTX、MMF及PTX＋MMF对高糖条件下MCs内MCP-1 mRNA及蛋白、FN表达的影响。结果高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加（P〈0.01）,且48 h表达最高;不同浓度的PTX、MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达（P〈0.01）;不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性（P〈0.05）;不同浓度的PTX则随着时间的延长对其抑制作用无明显差别;PTX联合MMF组比单独PTX各组在各时间点的抑制程度更明显（P〈0.01）,比单独MMF各组在各时间点抑制作用增强,（24 h,P〈0.05）,但随着时间延长,差异无统计学意义。结论 PTX及MMF可能通过阻抑MCP-1的表达及FN的分泌延缓糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）中肾小球硬化及间质纤维化的进展,联合给药组作用优于单药,可能从改善血流动力及抗炎角度解释了PTX联合MMF对DN肾脏的协同保护作用。     

血液透析、血液透析滤过及连续肾脏替代治疗对尿毒症毒素的清除作用及对动脉粥样硬化程度的影响

目的探讨不同血液净化方式对尿毒症毒素的清除效果及对动脉粥样硬化程度的影响。方法选择2013年1~12月在武汉大学人民医院进行血液净化治疗的尿毒症患者68例,根据透析方法分为单纯透析（HD）组（22例）,血液透析＋血液透析滤过（HD＋HDF）组（28例）,血液透析＋连续肾脏替代治疗（HD＋CRRT）组（18例）。比较3组透析前后同型半胱氨酸（Hcy）、瘦素、晚期糖基化终产物（AGEs）、甲状旁腺激素（iPTH）变化、颈动脉内膜-中层厚度（IMT）及粥样硬化斑块面积。结果单次透析后HD＋HDF组和HD＋CRRT组Hcy[（21.8±5.3）、（21.6±7.2）μmol/L]、瘦素[（10.8±2.2）、（11.9±3.5）μg/L]、AGEs[（25.8±4.1）、（20.2±2.6）μg/L]、iPTH[（1.7±0.6）、（1.7±0.5）μg/L]均显著下降,差异均有高度统计学意义（P〈0.01）;单次透析后,HD＋HDF组和HD＋CRRT组Hcy、瘦素、AGEs以及iPTH均显著低于HD组[（37.3±19.9）μmol/L、（21.4±5.5）、（35.7±8.8）、（2.6±1.1）μg/L],差异均有统计学意义（P〈0.05）。治疗1年后,HD组瘦素[（25.7±4.3）μg/L]水平较1年前显著升高,差异有统计学意义（P〈0.05）,而HD＋HDF组和HD＋CRRT组Hcy[（26.3±8.1）、（26.9±7.4）μmol/L]、AGEs[（30.5±6.2）、（28.1±7.3）μg/L]及iPTH[（2.1±0.6）、（2.5±1.0）μg/L）]均显著下降,差异均有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。1年后Hcy、AGEs、iPTH、及瘦素三组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。治疗1年后,HD组动脉粥样斑块面积显著增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。Hcy、瘦素、AGEs及iPTH与颈动脉IMT呈正相关（r=0.48、0.80、0.73、0.41,P〈0.05或P〈0.01）,与粥样硬化斑块面积呈正相关（r=0.54、0.66、0.61、0.43,P〈0.05或P〈0.01）。结论常规HD不能有效清除尿毒症毒素,而HDF或CRRT能够有效清除相关毒素,并延缓颈动脉粥样硬化的过程。尿毒症毒素与动脉粥样硬化具有正?     

二甲亚砜对细胞色素P450酶3A4和2C9的影响

目的 研究0.01%、0.05%、0.1%二甲亚砜（DMSO）对细胞色素P450（CYP450）酶系中3A4、2C9两个亚型基因及蛋白表达水平的影响。方法 Chang肝脏细胞经处理后,分为空白对照组（仅含培养液）、DMSO组（分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO处理）、睾酮组（分别采用1、10、100μmol/L睾酮处理）、利福平组（分别采用1、10、100μmol/L利福平处理）、DMSO＋睾酮组（分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋10μmol/L睾酮处理）、DMSO＋利福平组（分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋10μmol/L利福平处理）。利用逆转录定量PCR的方法,测定CYP3A4、CYP2C9基因水平的表达。利用蛋白免疫印迹法,测定CYP3A4、CYP2C9蛋白水平的表达。结果 0.1%DMSO组CYP3A4 m RNA高于空白对照组（P〈0.01）,且0.1%DMSO组CYP3A4蛋白的表达也高于空白对照组。0.01%、0.05%DMSO组CYP3A4 m RNA表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但0.01%、0.05%DMSO组CYP3A4蛋白的表达高于空白对照组。0.01%、0.05%、0.1%DMSO组CYP2C9 m RNA表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,0.01%、0.05%、0.1%DMSO组CYP2C9蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。0.01%、0.05%DMSO＋10μmol/L睾酮组CYP3A4 m RNA的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但0.01%、0.05%DMSO＋10μmol/L睾酮组CYP3A4蛋白的表达高于睾酮组。0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋10μmol/L利福平组CYP2C9 m RNA的表达与利福平组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋10μmol/L利福平组CYP2C9蛋白的表达高于利福平组。结论0.01%、0.05%、0.1%三个浓度的DMSO在体外肝细胞实验中对CYP3A4的表达有一定的影响,而对CYP2C9的表达影响不明显,当DMSO作为药物溶剂的时候,可能会影响药物单用时的实验结果。     

白藜三醇对缺氧状态下人脐静脉内皮细胞增殖及HIF—1α表达的影响

摘要：目的研究白藜三醇（resveratrol,Res）对缺氧状态下人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC）增殖及低氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor1,HIF-1μ）表达的影响。方法自藜三醇预孵育HUVEC2h后,采用氯化钴（CoCl2）化学方法制作缺氧模型,实验分为3组进行：正常组（NC）、缺氧组（HY）、药物组（0．1、1、5、10、50μmoL／LRes）。应用CCK-8法检测各组HUVEC增殖情况,免疫细胞化学法和Westernblot检测各组细胞内HIF-1α的表达。结果①缺氧组及药物组（0．1、1、5、10μmol/L）与正常组相比细胞增殖增加（P〈0．01）;1、5μmoL／L药物组与缺氧组比较细胞增殖增加（P〈0．01）,5μm0L／L药物组与其他各浓度组比较细胞增殖增加（P〈0．01）。②正常组HUVEC胞质内HIF-1α 仅微量表达;缺氧组胞质内HIF-1α阳性表达,较正常组增多,显色呈黄褐色;药物组（5μmol／L）胞质内HIF-1α强阳性表达,显色呈深黄褐色。③缺氧组与正常组相比HIF-1α 蛋白表达增加（P〈0．05）,药物组（1、5μmol／L）与正常组相比HIF-1α蛋白表达增加（P〈0．01）;1μmol／L药物组与缺氧组相比HIF-1α蛋白表达增加（P〈0．05）,5μmol／L药物组明显增加（P〈0．01）。结论白藜三醇可能通过促进HIF-1α 的表达而促进血管内皮细胞增殖,从而对新生血管的形成起到一定促进作用。