笃斯越桔果实总DNA提取方法的比较研究

目的探讨越桔果汁总DNA的最佳提取方法。方法分别采用SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳及RAPD-PCR检测。结果SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA其OD260/OD280分别为1.944、1.738、1.661、1.813,其浓度分别为2.363μg/μl、0.548μg/μl、0.735μg/μl、1.455μg/μl;电泳检测显示异硫氰酸胍法提取DNA条带最清晰,扩增产物最多。结论用异硫氰酸胍法提取越桔果汁总DNA优于其它方法。     

2种提取大鼠肝RNA方法的比较

目的建立大鼠肝RNA的提取方法,为逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及cDNA文库构建等分子生物学实验奠定基础。方法用Trizol法和异硫氰酸胍提取法提取大鼠肝RNA,紫外分光光度计测定RNA产量及纯度,琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。结果采用Trizol方法提取的RNA的OD260/OD280比值为2.28,异硫氰酸胍方法提取的RNA OD260/OD280比值为1.74。采用Trizol法提取RNA的产量高于异硫氰酸胍提取法,电泳分析18 s、28 s条带完整。结论Trizol提取的大鼠肝RNA纯度、收率都优于硫氰酸胍方法提取的RNA。     

鹌鹑肝组织胱硫醚β-合酶基因RT-PCR的实验研究

[目的]建立一种有效的鹌鹑肝组织胱硫醚β-合酶(CBS)RT-PCR,为实现CBS Real-time PCR提供条件。[方法]采取一步法,改进一步法,异硫氰酸胍法(重复抽提)和异硫氰酸胍法(一步法)四种方法提取总RNA,以CBS cDNA共有序列设计鹌鹑CBS引物,进行CBS RT-PCR引物筛选。[结果]除改进一步法外,其他三种方法提取的总RNA完整性好;除异硫氰酸胍法(一步法)外,其他三种方法提取的总RNA的A260/A280都在1.8以上纯度。异硫氰酸胍法(重复抽提)提取的总RNA极少残留DNA。[结论]四种方法都能较好地扩增CBS片段,一步法最省时。但异硫氰酸胍法(重复抽提)抽提得到的RNA质量较好.     

全血标本保存条件对人总RNA提取效率的影响

目的探讨全血标本保存条件对RNA提取效率和RNA完整性的影响。方法从179例保存在不同温度、不同时间的全血标本中提取总RNA,测定其浓度和纯度、分析其完整性。另选20例标本研究冻融次数对RNA提取效率的影响。179例中的73例总RNA在-80℃下保存1周前、后分别测定浓度和纯度,观察两者差异。结果新鲜血来源的总RNA浓度最高,平均306.51ng/μl;冻融2次全血仍可获得足量的RNA,浓度181.98ng/μl,RNA完整性有所下降;-80℃保存1周的RNA,浓度和纯度都略有下降。结论利用Trizol法可从小体积全血标本中获取足量有效的总RNA;不同保存条件全血中所获取的总RNA浓度存在差异;总RNA-80℃短期保存也会略有降解。     

Trizol与RNA Fast1000试剂盒提取外周抗凝血总RNA的方法比较

目的 比较传统Trizol法和试剂盒法提取血液中总RNA的效果.方法 我们将100份人体新鲜血液标本随机分为2组,每组各50份,分别用Trizol法和RNA Fast1000试剂盒法两种方法从外周血中提取RNA测定其纯度和完整性,通过两独立样本的t检验统计分析2组OD值比值数据的差异性.结果 试剂盒提取的总RNA的纯度(1.904±0.15)优于传统的Trizol方法(1.727±0.42).结论 与Trizol法相比,试剂盒法具有简便、快速、高纯度等特点,且提取的RNA样品质量较高,可直接用于RT-PCR合成、Northem杂交等分子生物学操作.     

血清HCV RNA不同提取方法的对比研究

目的:探讨不同方法提取丙型肝炎患者血清HCV RNA ,比较每种方法提取的RNA用于RT-PCR荧光定量检测的敏感度.方法: 分别采用异硫氰酸胍-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法、固相吸附法、柱式总RNA抽提法提取7例疑似 HCV感染者血清标本中的HCV RNA,采用实时荧光定量PCR法进行检测.结果:采用异硫氰酸胍-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法提取HCV RNA用于核酸检测有漏检现象,而采用固相吸附法和柱式总RNA抽提法,敏感度均可达到100%.结论采用固相吸附法和柱式总RNA抽提法提取血清HCV RNA具有较高的敏感度,在实时荧光定量PCR法检测中具有重要的临床价值.     

Trizol与RNA Fast1000试剂盒提取外周抗凝血总RNA的方法比较

目的比较传统Trizol法和试剂盒法提取血液中总RNA的效果。方法我们将100份人体新鲜血液标本随机分为2组,每组各50份,分别用Trizol法和RNA Fast1000试剂盒法两种方法从外周血中提取RNA测定其纯度和完整性,通过两独立样本的t检验统计分析2组OD值比值数据的差异性。结果试剂盒提取的总RNA的纯度（1.904±0.15）优于传统的Trizol方法（1.727±0.42）。结论与Trizol法相比,试剂盒法具有简便、快速、高纯度等特点,且提取的RNA样品质量较高,可直接用于RT-PCR合成、Northern杂交等分子生物学操作。     

磁珠法半自动提取全血基因组DNA条件的优化

目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案。方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响。结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80%时,DNA平均浓度最高。磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013)。当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μl时,OD260/OD280的比值较好。磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P<0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80%时,OD260/OD230的比值更好。结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80%的提取条件;而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得最优DNA提取效果。     

四种提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA方法的比较

目的比较四种联合提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA的方法。方法使用Trizol法、磁珠法、Qiagen~(TM) RNA Mini Kit和柱式RNA抽提试剂盒分别提取诺如病毒和副溶血性弧菌的总RNA,经核酸测定仪检测RNA的质量,并用RT-PCR法对四种提取方法进行比较。结果 Qiagen~(TM) RNA Mini Kit的提取效率最佳,对PCR的反应影响最小。磁珠法其次,但是磁珠法提取出的总RNA纯度也较高。Trizol法和柱式法总RNA抽提试剂盒所获得的总RNA比上述两者低,且存在不同程度的污染。经随机区组方差分析显示,四种提取方法之间存在显著性差异,F浓度=11.313;F(A_(260)/A_(280))=15.093;F(A_(260)/A_(280))=11.155,P均0.05。结论四种试剂的实际提取效率存在差异,应根据不同的样本情况选择合适的试剂。     

不同RT-PCR方法学的探讨

目的:探讨微量RNA标本的RT-PCR方法。方法:采集13例新生大鼠脊髓标本,提取RNA,分别稀释至1μg/μl、1ng/μl和1 pg/μl,分别以两步法RT-PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒,扩增β-actin基因,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察分析。结果:浓度为1μg/μl和1ng/μl的标本,三种方法均出现了目标带,而浓度为1 pg/μl的标本,两步法RT- PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒的阳性率分别为85%、77%和100%。结论:一步法敏感性高于两步法,微量RNA标本以采用Qiagen公司的一步法试剂盒进行RT-PCR实验为好。     

Ad/CMV- hTGF-β1 Treats Rabbit Intervertebral Discs Degeneration in Vivo

To investigate therapeutic efficiency of Ad/CMV- hTGF-β1 gene for rabbit intervertebral disc degeneration model. 60 Japanese white rabbits were selected to form the L5-L6 Anterior-Lateral-Anulus-Fibrosus-Incision-Induced model in order to simulate human intervertebral disc degeneration. 36 rabbits, whose corresponding intervertebral discs were injected with 20 μl (10 × 106 pfu)of Ad/CMV- hTGF-β1 gene, constituted the therapy group, 12 were injected with 20 μl (10 × 106pfu)of Ad/CMV-LacZ gene as comparison group, while 12 were only injected with equivalent capacity of saline for empty comparison group. 3 weeks after injection, examples were taken for investigation of HE staining, MRI, Western Blotting and immunobistochemical research TGF-β1.Wide distribution of TGF-β1 was detected by immunohistochemical research in the degenerated annulus fibrosus after injection. Western Blotting research showed significant increase of TGF-β1 content in intervertebral discs treated with TGF-β1 gene than comparison groups. MRI signal transformed from low to comparatively high and that intervertebral disc pathological degree improved.Ad/CMV- hTGF-β1 gene transfection is a potential method to increase TGF-β1 content and reverse intervertebral disc degeneration.     

CT引导臭氧消融术在腰椎间盘突出症中的应用

目的探讨CT引导下臭氧注射治疗椎间盘突出症的方法及临床应用价值。方法对300例腰椎间盘突出症患者在CT引导下经皮穿刺行臭氧治疗,采用盘内及突出物中央注射臭氧5～20ml,浓度为60μg／ml,椎间孔附近注射臭氧5ml,浓度为40M／ml。结果注射臭氧后即行CT扫描显示：臭氧在盘内分布呈裂隙状、积聚状、弥散分布状及大部分溢出盘外状。治疗后随访3～12月,依据MaCNab标准,显效174例,占54％,有效102例,占32％,无效42例,占14％,总有效率为86％,术后无并发症。结论CT定位引导穿刺操作简单,在严格掌握适应证前提下,经皮注射臭氧治疗腰椎间盘突出症是一种有效、安全的方法。     

犬椎间盘内注射医用三氧对NF-κB表达水平的影响

目的 观察犬椎间盘内注射医用三氧对NF-κB表达的影响.方法 选择健康本地犬15只,随机分为3组,每组5只.在DSA引导下行L1～2～L4～5椎间盘穿刺.A组（对照组）仅穿刺,不注射任何物质;B组（纯氧组）注射纯氧5 ml;C组（医用三氧组）注射30～50 μg/ml医用三氧5 ml.所有动物于操作后1周处死,取椎间盘组织,分别采用RT-PCR和Western-blot方法测定其中NF-κBp65mRNA与NF-κBp65蛋白的表达.结果 RT-PCR结果显示医用三氧组髓核细胞内NF-κBp65mRNA及蛋白表达水平均低于对照组与纯氧组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 犬椎间盘内注射医用三氧可降低椎间盘髓核细胞内核转录因子NF-κB的表达.     

小鼠腰椎间盘退变与OPG基因的关系研究

目的：比较骨保护素（OPG）基因敲除（OPG-／-）小鼠与正常（WT）小鼠腰椎间盘退变的关系。方法：分别取出生后4、8、12W的OPG-／-小鼠及正常对照组小鼠的L4,5椎间盘,运用番红O-固绿染色法观察L。／5椎间盘形态学变化,测量椎间盘及软骨终板高度。应用免疫组化染色观察椎间盘聚集蛋白聚糖（aggrecan）基因表达量的变化。结果：①小鼠腰椎间盘番红。-固绿染色结果：OPG_／-小鼠的椎间盘软骨终板在第8W及第12W时可观察到退化改变,软骨终板排列不规则,并有骨髓腔组织进入软骨终板及外层纤维环。②免疫组化染色结果显示：各年龄点OPG-／-组小鼠椎间盘aggrecan的蛋白表达均低于同龄WT组小鼠。③OPG-／-小鼠软骨终板及椎间盘高度在4周时较对照组无明显变化,随着年龄的增长,第8周时较对照组降低,第12周时高度下降最明显（P〈0．01）。结论：OPG基因缺失后可导致椎间盘退变,椎间盘正常的结构和功能的维持有赖于OPG基因。     

正常山羊腰椎间盘营养途径的DCE-MRI观察

目的 研究正常山羊腰椎间盘软骨终板营养途径.方法 选取健康24月龄山羊8只,每只山羊观察4个腰椎间盘,共32个腰椎间盘.麻醉后,行磁共振动态增强扫描,观察感兴趣区的信号变化特点.分别测量增强前及增强后0 min、5 min、10 min、30 rain、1 h、1.5 h、2 h,2.5 h、3 h、3.5 h感兴趣区信号强度值,分析时间-信号强度曲线及峰值出现时间.结果 椎体磁共振信号强度在0 min时达到高峰后迅速下降;软骨终板区在30 min时缓慢达到第一高峰后轻度下降,于2 h上升达到第二高峰;髓核在5 min内为负值,之后缓慢上升于2 h达到高峰,随后逐渐下降.结论 正常山羊腰椎椎间盘主要通过软骨终板途径进行营养代谢.     

益气化瘀补肾方对退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响

目的：观察益气化瘀补肾方血清对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响。方法：取6例确诊为脊髓型颈椎病的住院患者行颈椎减压融合手术摘除的退变椎间盘组织块,采用组织块法培养原代细胞;SD大鼠10只,灌胃制备大鼠益气化瘀补肾方含药血清。取传代第1代的退变椎间盘细胞,分为益气化瘀补肾方含药血清高浓度组（20%）、中浓度组（10%）、低浓度组（5%）及相应体积比浓度氯化钠溶液血清对照组。MTT法检测不同浓度的益气化瘀补肾方血清对椎间盘细胞增殖的影响,实时荧光定量聚合酶链反应检测不同给药时间点各组椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA的表达。结果：第1代退变椎间盘细胞传代第6天时细胞增殖达到顶峰,8d后开始下降,故选择细胞传代第6天为给药干预时间点。与对照血清比较,不同浓度的益气化瘀补肾方血清可促进退变椎间盘细胞的增殖（P〈0.01）,提高退变椎间盘细胞蛋白聚糖mRNA的表达（P〈0.01）,并下调Ⅹ型胶原mRNA的表达（P〈0.01）,且以中浓度的作用最为明显（P〈0.05）。结论：益气化瘀补肾方通过调节退变椎间盘的胶原及蛋白多糖的表达而产生有效防治脊髓型颈椎病椎间盘退变的作用。     

经皮激光加臭氧联合治疗腰椎间盘突出症106例疗效分析

目的：观察经皮穿刺激光加臭氧消融术联合治疗腰椎间盘突出症的疗效。方法：患者俯卧位,局麻后在透视定位下经皮穿刺进入病变椎间盘中心,应用半导体激光（功率0-15 W,波长980 nm）、医用臭氧发生器联合进行髓核汽化减压及消融,单间隙总能量控制在1 000-1 200 J,臭氧浓度40-50 mg/L,共治疗106例118个椎间盘。结果：所有患者穿刺治疗成功,术后1、3、6、12个月随访,总有效率99.0%,优良率95.3%,无手术并发症发生。结论：经皮激光加臭氧联合治疗腰椎间盘突出症是微创治疗椎间盘疾病的有效方法,联合治疗显著提高了治疗有效率。     

后入路经椎管及硬膜囊臭氧靶点注射治疗腰椎间盘突出症

目的评估CT介导下后入路经椎管及硬膜囊椎间盘内医用臭氧精确注射治疗腰椎问盘突出症的疗效及优势。方法 262例腰椎间盘突出症患者于CT介导下从背部棘突旁开约1～2 cm后入路经椎管及硬膜囊穿刺到达椎间盘内,臭氧注射靶点为椎问盘、突出髓核及患侧硬膜外间隙神经根周围。椎间盘及突出髓核内医用臭氧浓度40～50μg/ml,神经根旁医用臭氧浓度30μg/ml。结果所有患者治疗成功。术前平均JOA评分为(8.30±1.40)分,下肢根性痛VAS评分平均为(8.73±0.80)分;术后3月随访JOA评分平均为(24.16±3.20)分,下肢根性痛VAS评分平均为(2.41±0.20)分;术前及术后JOA评分和VAS评分均存在显著差异(P值分别0.0158和0.0242)。按照改良的MacNab分级法,165例患者达到优,64例达到良,可20例,差13例,总优良率达87.4%。全部患者均未见任何严重并发症。结论 CT介导下后入路经椎管及硬膜囊腰椎间盘内医用臭氧注射能够达到精确的靶点注射,手术安全,可以提高治疗腰椎间盘突出症的效果。