实时荧光RT-PCR快速检测肠道病毒RNA及其临床意义

目的应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法快速检测肠道病毒RNA,为手足口病的早期诊断提供临床依据。方法采用实时荧光RT-PCR法检测手足口病患儿粪便、脑脊液中肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组16(CA16)和肠道病毒71型(EV71)RNA。结果 234份粪便标本中肠道病毒通用型阳性214例,检出率为91.45%;CA16阳性56例,阳性率为23.50%;EV71阳性87例,阳性率37.17%,其中有4例同时检出CA16和EV71。2份脑脊液标本中3种肠道病毒核酸结果均为阴性。结论实时荧光RT-PCR能对肠道病毒RNA进行快速检测,为手足口病的早期诊断提供诊断依据,并对手足口病患儿的病情分析、治疗及预后观察起到指导作用。     

PCR检测东莞市2014～2015年度手足口病患儿肠道病毒结果分析

随机选取东莞市2014~2015年度在我院住院治疗的手足口病患儿150例,用实时荧光定量PCR法检测患儿肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)。分析我市手足口病患儿肠道病毒感染状况,不同性别和不同年龄阶段患儿肠道病毒的感染状况。EV71、CA16阳性率分别为55.33%,7.33%;男患儿EV71阳性率为46.67%,女患儿EV71阳性率为64.00%,差异存在明显的统计学意义(P<0.05);男患儿CA16的阳性率为5.33%,女患儿CA16的阳性率为9.33%;<1岁患儿EV71的阳性率为33.33%,CA16的阳性率为0%;1~2岁患儿EV71的阳性率为48.68%,CA16的阳性率为5.26%;>2岁患儿EV71的阳性率为76.00%,CA16的阳性率为14.00%。三组不同年龄阶段的患儿EV71阳性率两两比较,差异存在显著的统计学意义(P<0.01)。东莞市手足口病病原以EV71型为主,女患儿EV71感染的阳性率明显高于男患儿,>2岁患儿EV71病毒的检出阳性率最高。     

胶体金免疫法对手足口病分型检测的研究

目的 建立胶体金免疫法(CGIA)对手足口病(HFMD)分型的检测方法.方法 用双抗体夹心检测原理建立CGIA对HFMD分型检测方法,分别检测136例HFMD患儿和30例健康儿童粪便中柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠病毒71型(EV71),以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)为金标准,评价CGIA检测性能.结果 CGIA 与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便EV71阳性率分别为27.2%和28.6%;CGIA与RT-PCR检测136例手足口病患儿粪便CA16阳性率分别为33.8%和35.3%;以RT-PCR为金标准,CGIA检测手足口病患儿粪便EV71的敏感性89.7%,特异性89.7%,阳性预测值94.5%,阴性预测值95.9%,准确度95.5%;CGIA检测手足口病患儿粪便CA16的敏感性85.4%,特异性94.3%,阳性预测值89.1%,阴性预测值92.2%,准确度91.1%.结论 CGIA法操作简单、方便、快速,特异性和敏感性好,为HFMD病原学早期分型诊断提供了一个有效的检测手段.     

西安地区儿童手足口病病原学分析

目的 对西安地区手足口病病原学进行分析调查,为手足口病防治提供科学依据.方法 采集2010年5月～6月432例临床诊断为手足口病患儿咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法检测肠道病毒通用型（EV）、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）.结果 EV阳性率82.87%（358/432）,EV71阳性率25.93%（112/432）,CA16阳性率21.06% （91/432）,EV71阳性率与CA16阳性率比较差异无统计学显著性意义（χ2=2.84,P〉0.05）.22例重症患者11例由EV71引起,2例由CA16引起.结论 西安地区手足口病病原以EV71和CA16多见,高发于4岁以下儿童,重症患者主要由EV71引起.     

某地区2010年手足口病患者肠道病毒RNA实时荧光逆转录PCR检测结果分析

目的用实时荧光定量RT-PCR技术检测惠州市2010年手足口病患者肠道病毒RNA,了解手足口病病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据。方法采集2010年1～12月本院送检的1712例手足口病患者的粪便、肛拭子、咽拭子和脑脊液等标本5849份,应用荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)。结果男性及女性EV、EV71和CA16感染率分别为68.15%、43.61%、5.56%和61.23%、37.03%、5.70%;共检出1123份EV阳性标本,705份EV71阳性标本,96份CA16阳性标本,阳性率分别为60.28%、33.35%和5.13%;4～6月和7～9月是手足口病发病高峰期,感染肠道病毒EV、EV71型、CA16型人数分别占所有肠道病毒EV、EV71、CA16型感染者的36.33%、49.50%、42.70%和42.56%、38.72%、40.63%;0～4岁的儿童是手足口病的高发人群,占所有患者的85.46%。结论惠州市2010年手足口病的病原以肠道病毒71型为主,夏秋季节是手足口病发病高峰期,0～4岁儿童是感染肠道病毒的高危人群。     

手足口病相关肠道病毒感染血清IgM抗体交叉反应及动态变化

目的分析手足口病相关肠道病毒间IgM抗体交叉反应及动态产生过程,评价抗体捕获法检测肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染的早期诊断价值。方法收集广州市妇女儿童医疗中心319名手足口病患者及疑似患者咽拭子319份、血标本565份。荧光定量PCR检测咽拭子标本,血清中和试验检测配对血清,结合两法结果为判断标准,将手足口病患者分为EV71、CA16及其他肠道病毒感染组;以捕获ELISA法检测不同发病时间EV71-IgM抗体及CA16-IgM抗体。结果发病第一天均能检测出EV71-IgM抗体及CA16-IgM抗体,阳性率分别为33.0%和25.0%,检出率分别在第5天和第7天达到100%,抗体可持续检出时间达数月。EV71感染血清CA16-IgM捕获ELISA法交叉反应率为25.0%,CA16感染血清EV71-IgM捕获ELISA法交叉反应率为28.0%。EV71-IgM和CA16-IgM抗体存在严重交叉反应,通过两者450 nm处吸光度(A450 nm)比值可以成功诊断97.1%EV71感染和93.0%CA16感染。同一天采集的肛拭子及血清标本检测结果表明,荧光定量PCR与ELISA法诊断EV71及CA16感染的结果差异无统计学意义。结论 EV71及CA16抗体捕获ELISA法是一种简单、有效的诊断方法,联合两种方法检测可以有效提高诊断特异性。     

502例手足口病患儿实验室检测结果的分析

目的观察手足口病患儿的实验室检测结果,并探讨其意义。方法收集502例(重症型104例,轻症型398例)手足口病住院患儿的咽试子标本,采用实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法对手足口病患儿肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)以及柯萨奇病毒A组16型(CA16)核酸进行检测。同时检测白细胞(WBC)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)并进行分析。结果 502例手足口病患儿中,EV、EV71、CA16感染阳性分别为384例(76.49%)、262例(52.19%)、39例(7.76%)。男性患儿多于女性患儿,104例重症型手足口病患儿中,EV71阳性率为92.31%;502例手足口病患儿中有402例3岁。104例重症型患儿有97例(93.27%)3岁;其中EV71阳性率92.78%(90/97)。重症型与轻症型相比,重症型手足口病患儿WBC、LDH、CK-MB、DBIL和ALT水平较高(P0.05)。结论手足口病患儿以3岁为主,感染的肠道病毒主要为EV,引起重症型的主要病原体为EV71。     

手足口病患者体内肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型与常见呼吸道病毒的检测及临床分析

目的 调查手足口病患者中EV71和CA16的感染现状,分析呼吸道病毒合并感染对患者的影响.方法 收集2010年6-10月在北京佑安医院就诊的手足口病患者348例,包括门诊轻症患者100例,住院患者248例.采集患者咽拭子标本提取病毒RNA,用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA,荧光PCR法检测EV71和CA16.以呼吸道病毒多重PCR引物扩增12种呼吸道病毒的基因片段,通过电泳分析判断结果.比较EV71(+)或CA16(+)组与EV71(-)CA16(-)组合并呼吸道病毒感染阳性率和重症患者比例,住院与门诊手足口病患者中合并感染呼吸道病毒的阳性率.结果 348例手足口病患者,共检测出呼吸道病毒感染36例.在248例住院手足口病患者中,111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率7.2%,相比137例EV71(-)CA16(-)组患者呼吸道病毒感染率7.4%,差异无统计学意义(x2=0.059,P＞0.05).在100例门诊轻症手足口病患者中,有17例(17%)合并呼吸道病毒感染,高于111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率,差异有统计学意义(x2=4.830,P＜0.05).在111例EV71(+)或CA16(+)组中,重症患者为101例(91.0%);在137例EV71(-)CA16(-)组中,重症患者为132例(96.4%),两组重症患者率差异无统计学意义(x2=3.099,P＞0.05).在348份标本中检出占前3位的呼吸道病毒分别是人鼻病毒A/B(HRV A/B)、人副流感病毒3(PIV3)、甲型流感病毒(FLU A).结论 手足口病患者中存在呼吸道病毒合并感染,但合并感染对手足口病病情未见明显影响.     

一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒

目的探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值。方法以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71。结果64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64)。实时荧光RT-PCR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性。结论实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断。     

1728例手足口病病原学检测结果分析及临床意义

目的：了解宜春市手足口病病原学特征，为手足口病的防控提供实验室依据。方法收集全市各区县所采集的手足口病标本及其流行病学资料，运用Real-Time PCR(PCR-荧光探针法)对所采集标本进行EV71、CA16型以及其它EV通用型的核酸检测。结果宜春市手足口病1728例患者中，检出阳性病例数共计1062例，阳性率为61.5%；EV71、CA16和EV通用型核酸阳性率分别为23.9%、15.2%、22.3%；在核酸检测阳性病例中，男性占63.3%，女性36.7%；阳性者年龄以1岁～3岁为主；重症病例的EV71、CA16和EV通用型核酸阳性率分别为55.0%、0.2%、10.0%。结论对手足口病原体的流行病学分析有助于做好手足口病的防控工作。     

西安地区2011年儿童手足口病病原学分析

目的 对西安地区2011年手足口病病原学进行分析,为手足口病的临床诊断、治疗及防治提供科学依据.方法 采集2011年1月～6月555例(其中男性347例,女性208例,年龄范围8个月～6岁,平均年龄2.6岁)西安市儿童医院临床诊断为手足口病患儿咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法检测肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16).结果 56例重症患者其中45例由肠道病毒71型(EV71)引起,占重症病例的80.4％(45/56),4例由柯萨奇病毒A组16型(CA16)引起,占重症病例的7.1％(4/56).肠道病毒71型(EV71)阳性率与柯萨奇病毒A组16型(CA16)阳性率差异有统计学显著性意义(x2=273.4,P＜0.0001).结论 西安地区2011年手足口病病原学以肠道病毒71型(EV71)为主,与2010年相比肠道病毒71型(EV71)感染有上升趋势,且高发于3岁以下儿童组,重症患者与2010年相同,主要由肠道病毒71型(EV71)引起.     

捕获ELISA法测定抗EV71-IgM抗体用于EV71感染早期诊断

目的探讨捕获ELISA法测定抗肠道病毒71型(EV71)IgM抗体在EV71感染所致手足口病(HFMD)早期诊断中的价值。方法以实时荧光RT-PCR检测89例临床初诊为HFMD患儿的粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子的肠道病毒RNA。用40例排除HFMD的5岁以下儿童血清为抗EV71-IgM抗体阴性对照,以捕获ELISA法检测患儿不同发病期血清中抗EV71-IgM抗体。结果经实时荧光RT-PCR检测,89例HFMD患儿粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子中EV71感染28例,柯萨奇病毒A16(CA16)感染43例,非EV71和CA16的肠道病毒感染14例,非肠道病毒感染4例。EV71感染者发病1～3 d、4～6 d及>6 d的血清抗EV71-IgM抗体阳性率分别为81.3%、100%和100%;CA16感染者分别为10.0%、26.4%和65.7%;非EV71和CA16的肠道病毒感染者及非肠道病毒感染者在发病1～3 d和4～6 d无1例阳性;阴性对照组无1例阳性。抗EV71-IgM抗体在EV71感染的早期(急性期)的诊断敏感性和特异性分别为81.3%和92.9%。结论 EV71感染者与CA16感染者血清抗EV71-IgM抗体在发病4 d后存在较明显的交叉反应。抗EV71-IgM抗体可用作EV71感染早期诊断的血清学标志物。     

单管多重RT-PCR检测肠道病毒核酸及其临床应用

目的建立一种快速检测肠道病毒通用型(EV)、科萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)核酸的单管多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR),并探讨其临床应用价值。方法建立单管多重RT-PCR检测EV、CA16和EV71的反应体系,并优化退火温度、各引物比例和循环参数等反应条件;采用自建RT-PCR体系检测136例手足口病患儿大便标本的肠道病毒核酸。结果单管多重RT-PCR检测体系的最佳反应条件:退火温度为54℃;EV、CA16和EV71引物比例为2∶1∶1;循环参数为35。采用自建单管多重RT-PCR从136例标本中检出EV阳性46例(33.82%),CA16阳性14例(10.29%),EV71阳性14例(10.29%),其中CA16、EV71同时阳性2例。结论成功建立检测EV、CA16和EV71核酸的单管多重RT-PCR,并应用于手足口病患儿的病原学检测。     

实时荧光定量PCR快速诊断肠道病毒71型感染

目的探寻快速准确早期诊断肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染的方法。方法手足口病患儿871例,采用实时荧光定量PCR检测患儿咽拭子或疱液的EV71感染情况,实时荧光定量PCR检测EV71阳性患儿采用ELISA法检测血清EV71-IgM和EV71-IgG。结果871份标本中,RT-PCR检测EV71感染阳性率为17.91%,其中5月份检测阳性率(24.44%)最高,12月份检测阳性率(4.17%)最低;随机抽取64例RT-PCR检测阳性患儿外周血,EV71-IgM阳性率为51.56%,EV71-IgG阳性率为14.06%。结论 RT-PCR能快速准确诊断EV71早期感染。     

手足口病病原体流行特征分析及护理

目的：对2013年3—6月手足口( HFMD)流行期间的449例HFMD患儿进行病原学流行特征分析,探讨其对临床护理实践的启示,为制定 HFMD 患儿的护理措施提供参考。方法收集2013年3—6月期间449例手足口病患儿的资料,用荧光定量RT-PCR法进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)定量分型。结果449例HFMD患儿肠道病毒总阳性率为69.5%(331/476),其中EV71型203例、CA16型109例,重症组的患儿EV71阳性率高于轻症组,两组比较差异有统计学意义(χ2=52.981,P<0.05)。结论 HFMD患儿以EV71型流行为主,重症手足口病多发生于年龄<3岁的儿童,且基本为EV71型感染。重视肠道隔离仍是手足口病防治的重点。     

887例手足口病患儿血清抗体及白细胞计数结果分析

目的：了解我院手足口病患儿血清抗体及白细胞变化的情况。方法回顾性分析我院2013年10月至2014年2月887例手足口病患儿血清柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)抗体和白细胞检测结果。结果887例标本抗体总阳性率为58.9%,其中CA16和EV71两种抗体均阳性的占28.4%,CA16抗体阳性占53.1%,EV71抗体阳性占34.2%,两者存在显著性差异;病毒抗体阳性标本中白细胞增高(>10×109),占46.4%,抗体阳性白细胞增高(>20×109)39例,占16.1%,其中CA16和EV71两种抗体均阳性的有26例,占66.7%,且均为重症手足口病,两种抗体均阳性与单独一种抗体阳性引起的白细胞增高存在显著性差异。结论对于CA16和EV71两种抗体均阳性且白细胞增高(>20×109)的手足口病患者,应及时干预,防止病情向重症发展。     

不同方法提取血清总RNA的性能评价

目的 评价3种方法提取血清总RNA的性能.方法 分别用Trizol法、磁珠总RNA提取法(磁珠法)、柱式总RNA提取法(柱式法)提取血清总RNA.通过测定样品OD260/OD280值评价提取的总RNA纯度、产量;通过设计引物及TaqMan探针扩增总RNA的管家基因(GAPDH),以观察各方法提取的总RNA用于RT-PCR的效果.结果 3种方法提取总RNA纯度分别为Trizol法(1.83±0.19)、磁珠法(1.94±0.11)、柱式法(1.92±0.12);扩增管家基因GAPDH,其Ct值分别为Trizol法(19.37±3.51)、磁珠法(18.33±1.11)、柱式法(18.85±1.20).结论 磁珠法、柱式法明显优于Trizol法,磁珠法与柱式法结果 差异无统计学意义(P>0.05).     

检测EV71和EV-U的TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR的建立

目的 建立一种针对手足口病病原体的快速准确检测方法。 方法 利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U),用含有目的序列RNA的标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果 用TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR法检测CoxA16、CoxB2、EV71病毒和其他人类病毒RNA,证实其特异性为100%;对EV71和EV-U的检测灵敏度均达到10^{2拷贝/μl;将EV71和EV-U的RNA标准品进行重复性实验,其批内、批间变异系数分别为0.97%～2.02%和0.89%～2.13%。 结论 本方法灵敏度较高,特异性强,重复性好,适用于手足口病的临床检测。}     

手足口病1073例病原检测分析

目的分析手足口病低龄儿童病例的肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）的感染状况。方法采集手足口病（HFMD）疑似病例咽拭子标本,采用实时荧光定量PCR方法检测患者EV71和CA16感染情况,并分析患者性别、年龄分布情况。结果收集到1 073例HFMD儿童疑似病例的咽拭子标本和临床资料,EV71男女总的阳性检出率为46.04%,CA16男女总的阳性检出率为9.04%。结论本次北京地区HFMD疫情的主要病原体包括EV71和CA16,EV71感染率高于CA16,分析结果可为HFMD防治提供参考。     

2016-2018年钦州市手足口病住院患儿病原学检测结果分析

目的分析2016-2018年该院住院患儿手足口病的病原构成及其变化,为钦州地区儿童手足口病的防治提供科学依据。方法采集2016-2018年该院诊断为手足口病的住院患儿粪便标本778份,采用实时荧光定量PCR方法,进行肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、CA6和CA10的检测。分析不同性别、不同年龄及不同月份肠道病毒型的检出率是否存在差异。结果 2016-2018年各年收治的患儿数分别为266、319、193例,病原检测阳性率分别为88.72%、89.34%、89.12%。其中2016年以EV71型为主,2017年以CA6为主,2018年以CA16为主。各型肠道病毒阳性患儿的构成比在不同年份之间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。患儿主要为4岁以下儿童,1～2岁儿童高发。手足口病发病高峰期在5-7月以及9-10月。手足口病感染率每年从4月份开始上升,11月份下降,呈现夏秋季节流行特征。结论 2016-2018年钦州市手足口病优势病原体存在一定差异,分别为EV71、CA6及CA16型。持续检测病原体的变化对手足口病的防治具有重要的临床意义。