姜黄素诱导鼻咽癌NCE细胞凋亡机制的研究

目的探讨姜黄素诱导人鼻咽癌NCE细胞凋亡的分子机制。方法通过吖啶橙-嗅化乙锭复合染色、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶分析法检测、电镜和DNA片段化分析法分析姜黄素对NCE细胞凋亡的影响，并应用流式细胞术、Western Blot、RT—PCR方法探讨姜黄素对细胞线粒体膜电位、半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine proteases-3，caspase-3）酶活性、胞质CytC、Fas mRNA及蛋白表达的影响。结果终浓度100μmol／L的姜黄素可诱导NCE细胞凋亡；与姜黄素共孵育12、24、48h，凋亡细胞的阳性率分别为25．6％、40．3％、54．5％。姜黄素处理后NCE细胞线粒体膜电位下降，12、24、48h的线粒体膜电位下降的阳性率分别是26．8％、42．3％、68．2％。caspase-3酶活性增强，12、24、48h表达caspase-3酶活性细胞的阳性率分别是80．5％、100％、100％。胞质CytC含量显著增强，Fas mRNA及蛋白表达水平上升，Fas蛋白阳性率由33．6％上升到89．9％。结论姜黄素可能通过线粒体途径与死亡受体途径诱导鼻咽癌NCE细胞凋亡。     

抗癌活性肽对鼻咽癌细胞周期的影响

目的探讨抗癌活性肽(anti-cancer bioactive peptide,ACBP)肝肽和科脾肽对人鼻咽癌细胞株CNE体外增殖抑制作用及细胞周期的影响。方法将人鼻咽癌CNE细胞与不同浓度的ACBP进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度的ACBP对CNE细胞的生长抑制率;光镜下观察形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期与凋亡率。结果质量浓度5．0-20．0μg／ml的ACBP均能抑制CNE细胞的生长,且随浓度及作用时间延长抑制率上升,20．0μg／ml ACBP作用72 h后,肝肽组的抑制率为63．0％,科脾肽组抑制率为46．7％。光镜下可观察到ACBP作用后的细胞凋亡现象。流式细胞仪结果显示:5．0μg/ml肝肽和科脾肽作用CNE细胞24 h的早期凋亡率较高,分别为(11．8±0．3)％和(8．1±0．2)％,分别与对照组比较,差异均有统计学意义(t值分别为42．535和47．300, P值均为0．000);20．0μg／ml的肝肽和科脾肽作用CNE细胞,随作用时间延长S期细胞构成比有明显上升。结论肝肽和科脾肽对CNE细胞均有抑制增殖的作用,其抗鼻咽癌细胞增殖作用机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡,调控肿瘤细胞周期。     

鼻咽癌细胞株C666-1细胞中酪氨酸激酶受体B的表达与抗失巢凋亡的关系

目的 探讨酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)对鼻咽癌细胞系C666-1失巢凋亡特性的影响和调控.方法 用反转录聚合酶链反应(PT-PCR)以及蛋白质印迹法检测培养的C666-1细胞中TrkB以及其配体脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达.采用TrkB的抑制剂K252a以及其配体BDNF分别作用于C666-1细胞,采用软琼脂集落形成实验观察细胞的集落形成能力以及悬浮培养后用活细胞计数kit-8(cell counting kit-8,CCK-8)法和膜联蛋白V碘化丙啶(annexin V-propidium iodinate,Annexin V-PI)双染色法检测对细胞的增殖和凋亡的影响.通过蛋白质印迹法观察TrkB、BDNF、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(serine threonine kinase,Akt)等蛋白在实验前后的表达变化的情况.结果 培养的C666-1细胞表达TrkB及BDNF.C666-1细胞受K252a作用后在软琼脂中集落细胞数减少,而在BDNF作用下集落细胞数增加.在悬浮培养状态,K252a对C666-1细胞的增殖具有抑制作用,经K252a作用后C666-1细胞的TrkB表达下调,并同时下调磷酸化的Akt蛋白(p-Akt);而BDNF作用后,内源性BDNF表达增强,且TrkB和p-Akt的表达上调.结论 TrkB具有抑制鼻咽癌细胞C666-1失巢凋亡的作用,K252a能够抑制TrkB的表达从而诱导凋亡,是具有潜力的酪氨酸激酶抑制剂.     

siRNA干扰与鼻咽癌基因治疗

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国华南、西南地区高发的恶性肿瘤之一.随着分子生物学的不断发展,对鼻咽癌的治疗手段也由传统的放疗、化疗向手术和基因领域拓展,小分子RNA(siRNA)干扰技术巳逐渐成为鼻咽癌等头颈肿瘤的重要研究方向.本文就siRNA及其干扰技术在鼻咽癌基因治疗中的研究及进展做一综述.     

EGCG联合放疗治疗鼻咽癌裸鼠移植瘤模型

目的 研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗的增敏效应及survivin和VEGF的表达及意义.方法 体外培养低分化鼻咽癌CNE-2细胞,接种于20只雄性裸鼠皮下,待肿瘤结节约4～6 mm时,随机分为生理盐水组、EGCG组(30 mg/kg)...     

塞来昔布联合放射对鼻咽癌细胞株凋亡的影响

目的 探讨塞来昔布联合放射对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡的影响及其可能的机制.方法 实验分4组进行,分别为对照组、药物组(25μmol/L塞来昔布)、照射组(8 Gy X线)和实验组(25 μmol/L塞来昔布+8 Gy X线照射).克隆形成实验检测塞来昔布对CNE-2Z细胞的放射增敏作用;流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率;免疫细胞化学染色检测B淋巴细胞-2(Bcl-2)、凋亡活化基因(Bax)蛋白表达;Western blot技术检测Caspase-3蛋白表达.结果 塞来昔布对人鼻咽癌细胞CNE-2Z有放射增敏作用,实验组中CNE-2Z细胞平均存活分数为0.50,细胞平均致死剂量为2.36,与对照组比较差异有统计学意义(P值均＜0.01);塞来昔布联合放射能够上调Bax的蛋白表达,对照组Box表达评分为1.221 ±0.116,实验组为2.758±0.256;同时抑制Bcl-2蛋白表达,对照组Bel-2表达评分为2.559±0.144,实验组为1.253±0.114,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);并明显增加肿瘤细胞的凋亡率(F=7.63,P＜0.01),差异有统计学意义;Western blot结果显示实验组Caspase-3蛋白表达增强.结论 Cox-2抑制剂塞来昔布联合放射能诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡,具有放射增敏作用.

Abstract：

Objective To investigate the effects of celecoxib combined with radiotherapy on apoptosis of CNE-2Z cell lines and the potential mechanisms.Methods Four groups were used,a control,celecoxib (25 μmol/L celecoxib) ,irradiation ( 8 Gy X ray) and celecoxib plus irradiation.The radiosensitising effect was detected by clone formation experiment.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells.The expressions of Bcl-2 and Bax were assessed by immunocytochemistry.Western blot was used to examine the expression of Caspase-3.Results Celecoxib enhanced the radiosensitivity of CNE-2Z cells.In experimental group,the mean surviving fraction and the mean lethal dose of CNE-2Z cells were 0.50 and 2.36 respectively.Compared with the irradiated group,there was significant differences between the two groups (P ＜ 0.01 ).Celecoxib combined with radiotherapy up-regulation the expression of Bax.The score of the expression of Bax in the control group and the experimental group were 1.221 ±0.116 and 2.758 ±0.256 respectively.Celecoxib combined with radiotherapy could inhibit the expression of the protein of Bcl-2.The score of the expression of Bcl-2 in the control group and the experimental group were 2.559 ± 0.144 and 1.253 ± 0.114 respectively,with significant differences ( P ＜ 0.01 ).Celecoxib combined with radiotherapy cound increase the apoptosis rate of tumor cells with significant differences ( F =7.63,P ＜ 0.01 ).Western blot showed that the expression of Caspase-3 was strengthened.Conclusion Celecoxib combined with radiotherapy could induce apoptosis and enhance the radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cell lines.     

塞来昔布抑制人鼻咽癌细胞株HNE-1细胞增殖与血管内皮生长因子的表达

目的 研究环氧化酶2抑制剂塞来昔布对鼻咽癌细胞株HNE-1细胞增殖作用及对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法 采用噻唑蓝法[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]观察塞来昔布对人鼻咽癌细胞增殖的影响，流式细胞仪分析细胞周期分布，免疫细胞化学检测VEGF蛋白表达。结果 塞来昔布50μmol／L作用48h后使HNE-1细胞G0／G1期细胞显著增多（由62．13％上升至91．35％），而G2／M期和S期细胞显著减少（分别由21．59％降至3．56％和16．28％降至5．01％），细胞生长停滞于G1／S期，细胞VEGF蛋白表达明显减弱。结论 塞来昔布对体外培养的鼻咽癌细胞具有明显抑制作用，使细胞生长停滞于G1／S期，且能抑制VEGF蛋白表达。     

Effect of transduction bax gene on experimental nasopharyngeal carcinoma]

OBJECTIVE: To evaluate the effect of transduction bax gene on nasopharyngeal carcinoma (NPC). METHODS: The transduced bax gene was mediated by Dosper lipidsome to the HNE-1 cell lines, and confirmed by immunofluorescent stain. The apoptosis of the cell lines was studied by MTT stain and flow cytometry and the growth of implanted tumor in naked mouse after local injection of bax geneobserved. RESULTS: Instantaneous expression of bax gene in HNE1 cell lines was testified by immunofluorescent stain after transduction for 48 hours, the apoptotic index were 10.7% and 69.4% for pre- and post-transduction, respectively. MTT stain showed the values of A in 490 nm after transduction to be 2.004(36 h) and 1.902(48 h). The diameter of implanted tumor mass was (1.8 +/- 0.64) cm and (3.0 +/- 0.44) cm in experimental and control groups, respectively. CONCLUSION: The transduction bax gene can enhance the apoptosis of HNE1 cell lines and prevent growth of implanted tumor.     

抑癌基因PTEN在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的 :检测抑癌基因PTEN在鼻咽癌组织的表达缺失情况 ,探讨PTEN与鼻咽癌发生发展之间的关系。方法 :采用免疫组织化学SABC染色法观察鼻咽癌旁正常组织和鼻咽癌组织中PTEN蛋白的表达 ,并分析其与病理组织类型、病理分级和临床分期的关系。结果 :PTEN在鼻咽癌旁正常组织的表达缺失率 (13.3% )低于鼻咽癌组织的表达缺失率 (47.8% ) ,其差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;鼻咽鳞状细胞癌PTEN的表达缺失率(5 8.1% )高于分化型和非分化型非角化癌 (30 .8% ) ;高、中、低分化的鼻咽鳞状细胞癌中 ,PTEN的表达缺失率依次递增 (分别为 2 5 .0 %、6 3.2 %、83.3% ) ;鼻咽癌临床Ⅲ～Ⅳ期的PTEN的表达缺失率 (78.1% )高于临床Ⅰ～Ⅱ期 (2 1.6 % )。结论 :PTEN在鼻咽癌的发生及发展过程中有表达缺失 ,且与病理类型、病理分级、临床分期有关。     

利用RNA干扰效应阻抑鼻咽癌细胞bcl-xL基因表达和诱导癌细胞凋亡的研究

目的研究RNA干扰(RNA interference)效应对人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE-2Zbcl-xL基因表达的抑制作用及其对CNE-2Z细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用。方法使用美国Ambion公司提供的网上设计软件设计针对人bcl—xL基因的小干扰RNA(siRNA)序列，体外转录试剂盒合成siRNA；荧光素标记试剂盒标记siRNA；脂质体法将siRNA转入CNE-2Z细胞株。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率；RT—PCR法半定量检测siRNA对bcl—xL基因表达的抑制作用；噻唑蓝法检测siRNA对细胞生长增殖抑制作用；流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光，而在未转染siRNA对照组未见；各siRNA转染组bcl—xL mRNA表达水平有不同程度的下调，下调范围在10％～70％之间，而在未转染对照组内bcl—xLmRNA表达水平无明显改变；细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量依赖性(剂量增加，抑制率增高)和时间依赖性；各浓度siRNA4转染组可不同程度诱导CNE-2Z细胞凋亡。结论体外转录合成的siRNA能特异有效地下调bcl—xL基因的表达，不同序列特异性的siRNA下调bcl—xL基因表达的能力不同；瞬时转染bcl—xLsiRNA4能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡；siRNA不仅为基因组功能分析提供了强有力的工具，而且为抗鼻咽癌基因治疗提供了新的思路。     

抑癌基因p16,p21及p53在鼻咽癌的表达

目的：观察抑癌基因ｐ１６,ｐ２１及ｐ５３在鼻咽癌（ＮＰＣ）的表达,探讨其与ＮＰＣ的发生发展及预后的关系。方法：用免疫组化ＳＰ法检测了１１６例ＮＰＣ组织和１５例无瘤鼻咽（ＮＰ）组织的ｐ１６,ｐ２１及ｐ５３基因的表达情况。     

鼻咽癌组织细胞凋亡的检测

目的 :探讨鼻咽癌组织放疗后病理改变及其临床意义。方法 :采用TdT酶介导的生物素化dutp缺口末端标记技术和HE染色 ,检测 30例鼻咽癌组织放疗前后的细胞凋亡率 ,并比较放疗前后的组织病理改变。结果 :鼻咽癌组织放疗后的细胞凋亡率明显高于放疗前 ;放疗后的癌细胞分化趋好 ,但到放疗中期时凋亡率有所下降。结论 :鼻咽癌放疗一方面可加速癌细胞的凋亡 ,另一方面可能促使增殖的癌细胞朝分化好的方向发展 ,从而达到治疗目的     

pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌裸鼠肿瘤血管内皮细胞的作用

目的:研究pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌裸鼠中肿瘤血管内皮细胞的作用.方法:建立人鼻咽癌裸鼠模型,将16只成瘤鼠随机分成AdKDR-tk/丙氧鸟苷(GCV)组(治疗组)和AdKDR-tk/PBS组(对照组),每组8只.观察治疗前后肿瘤体积变化、病理组织形态学及用免疫组织化学的方法观察肿瘤微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达.结果:治疗组在前6 d肿瘤缓慢增长,第6天后肿瘤生长受到抑制,移植瘤体积逐渐缩小,而对照组瘤体体积持续迅速增长.治疗后第6、9、14天治疗组瘤体均明显小于对照组(均P＜0.01).治疗组鼻咽癌细胞形态与对照组无明显区别,但瘤组织中有大量的细胞坏死灶;对照组MVD 6.63±1.41,治疗组MVD 3.50±0.93,组间差异有统计学意义(P＜0.05);对照组比治疗组具有较高VEGF阳性表达,2组间VEGF表达的差异具有统计学意义.结论:AdKDR-tk/GCV系统具有抑制裸鼠鼻咽癌肿瘤血管增生及肿瘤生长的作用.