卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定

目的　表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原 (Pw Ag)基因 ,并评价其应用于免疫学诊断的价值。　方法　用 IPTG诱导表达已亚克隆入表达载体 p RESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因 ,以 SDS- PAGE和 Western blot分析鉴定表达产物。　结果　 SDS- PAGE电泳可见 32 ku处有 1条明显的蛋白质带 ,该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别。　结论　成功构建重组克隆 Pw Ag,其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性 ,推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断。     

卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定

目的 表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwAg)基因，并评价其应用于免疫学诊断的价值。方法 用IPTG诱导表达已亚克隆人表达载体pRESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因，以SDS—PAGE和Westernblot分析鉴定表达产物。结果 SDS-PAGE电泳可见32ku处有1条明显的蛋白质带，该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别。结论 成功构建重组克隆PwAg，其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性，推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断。     

卫氏并殖吸虫成虫cDNA文库的单抗筛选

目的　从卫氏并殖吸虫成虫cDNA文库中筛选并鉴定出可用于免疫诊断和免疫预防的基因克隆。方法　采用预吸收的抗肺吸虫成虫单克隆抗体筛选多次后得到 5个阳性克隆 ,经PCR扩增后测定其插入片段的大小。用辅助噬菌体做体内剪切 ,以抗生素平板筛选含重组质粒的阳性菌落。其中 3个克隆测定其DNA序列 ,用BLAST软件对所得DNA序列进行同源性比较。结果　得到 1,2 ,4三个不同阳性克隆 ,其长度分别为 1783bp、397bp和 1132bp ,分别与卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白 (P wyolkferritin)基因、鞘脂激活蛋白A(DictyosterliumdiscoideumsaposinA)基因和曼氏血吸虫主要卵抗原 (Smmajoreggantigen -P4 0 )基因同源。 结论　本研究首次报道用抗肺吸虫成虫单克隆抗体筛选卫氏并殖吸虫成虫cDNA文库 ,所获克隆1、2、4可能系肺吸虫免疫诊断和预防的相关基因     

卫氏并殖吸虫基因组DNA文库构建Ⅱ．基因组DNA文库的构建及鉴定

以ＥｃｏＲＩ酶切安徽地区卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ，电泳分离回收０．４～４ｋｂ的ＤＮＡ片段。与ＥｃｏＲＩ酶切并经牛肠碱性磷酸脂酶处理的大肠杆菌质粒ｐＵＲ２２２载体，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下重组连接，构建卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ文库，获得１．０８×１０６个重组克隆。经重组克隆质粒的快速鉴定和卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ探针菌落原位杂交证实，重组克隆中含有与卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ同源的ＤＮＡ插入片段，并初筛到１９个阳性重组克隆。表明卫氏并殖吸虫基因组ＤＮＡ文库构建成功。     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

保护性免疫血清及单克隆抗体筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　为寻找有效的抗日本血吸虫感染疫苗候选抗原分子。方法　用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,再用同法免疫鼠脾细胞制备的单克隆抗体对所获阳性克隆进行再筛选 ,并对免疫筛选的阳性克隆的cDNA插入片段进行PCR扩增。结果　兔免疫血清确定 12个阳性克隆 ,其中 6个克隆与 2株以上的单抗呈阳性反应 :PCR扩增cDNA插入片段大小约 40 0bp～ 1 4kb左右。结论　已筛选到与致弱尾蚴免疫兔血清及同法免疫制备单抗产生特异反应的阳性克隆 ,获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。     

斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆及由体定位

目的克隆斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,并研究该酶在斯氏狸殖吸虫的表达部位。方法通过RT-PCR方法扩增斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,TA克隆入pUCm-T载体,鉴定、测序;利用DNASIS程序推导其编码氨基酸序列,并比较分析与其相关虫种半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性。采用地高辛标记原位杂交技术检测该酶基因在斯氏狸殖吸虫成虫的表达及组织定位。结果经RT-PCR和对阳性克隆鉴定、测序后获得一cDNA序列,长495bp;同源性分析结果显示,该序列与相关虫种的半胱氨酸蛋白酶存在较高同源性,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。原位杂交结果显示斯氏狸殖吸虫成虫的肠管上皮呈阳性着色。结论克隆获得了斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶的表达部位主要为肠管上皮。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆及由体定位

目的 克隆斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,并研究该酶在斯氏狸殖吸虫的表达部位。方法 通过RT-PCR方法扩增斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,TA克隆入pUCm-T载体,鉴定、测序;利用DNASIS程序推导其编码氨基酸序列,并比较分析与其相关虫种半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性。采用地高辛标记原位杂交技术检测该酶基因在斯氏狸殖吸虫成虫的表达及组织定位。结果 经RT-PCR和对阳性克隆鉴定、测序后获得一cDNA序列,长495bp;同源性分析结果显示,该序列与相关虫种的半胱氨酸蛋白酶存在较高同源性,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。原位杂交结果显示斯氏狸殖吸虫成虫的肠管上皮呈阳性着色。结论 克隆获得了斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶的表达部位主要为肠管上皮。     

紫外线致弱童虫免疫家兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因。　方法　用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cD?鄄NA文库 ,对阳性重组子进行克隆、测序 ,利用软件对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出 6种蛋白分子基因 :3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) ,丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin) ,线粒体编码蛋白 ,肌球蛋白 (myosin)部分重链基因以及两个未知新基因。　结论　紫外线致弱疫苗免疫血清筛选cDNA文库为寻找新的抗血吸虫病疫苗提供了又一途径。     

卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的筛选和免疫反应性分析

目的 初步探讨卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的免疫反应性。方法 应用卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白(Pw-Ig)筛选噬菌体随机12肽库,对筛选到的抗原模拟表位用ELISA检测其免疫反应性,并与卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwA)进行比较。结果 获得的6个卫氏并殖吸虫抗原模拟表位(即P5、P6、P7、P8、P13、P16)特异性和敏感性与PwA相比差异均无显著性(P>0.05),其中P5、P6和P7交叉反应性明显较PwA低(x2=4.630,P<0.05),其余则与PwA无明显差异(P>0.05)。结论 卫氏并殖吸虫抗原模拟表位对卫氏并殖吸虫病的诊断具有潜在的应用价值,有望代替天然抗原用于卫氏并殖吸虫病的诊断。     

两种不同噬菌体筛选方法所获的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位抗原性比较

目的比较从兔抗蚯蚓血清免疫球蛋白(E-Ig)结合后的噬菌体12肽库中和从噬菌体肽库中筛选出的两种卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的抗原性。方法以肺吸虫病患者血清免疫球蛋白(Pw-Ig)作为靶分子,分别对噬菌体12肽库(PwA)和经过 E-Ig 筛选一轮后的肽库(PwB)进行3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛,随机挑取 PwA 和 PwB 蓝色噬菌斑各24个扩增,用 ELISA 方法检测并比较两者的抗原性。结果24个 PwA 克隆中有12个可以与肺吸虫病患者血清发生免疫反应,其中 A_(491)nm 值较高的2个克隆具有较好的特异性和敏感性;24个 PwB 克隆中有10个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清所识别,其中 A_(491)nm 值较高的2个克隆具有较好的抗原性。结论从 PwA 和 PwB 中均筛选到了对肺吸虫具有潜在诊断价值的抗原模拟表位,提示以异源性抗体结合后的肽库作为源肽库来筛选寄生虫抗原模拟表位是可行的,为研制新型诊断试剂提供了一条新的着眼点。     

抗卫氏并殖吸虫单克隆抗体的筛选及其在诊断中的应用

本文报道测定16种抗卫氏并殖吸虫(Pw)囊蚴和成虫单克隆抗体(McAb)的同型及其交叉反应。其中,抗Pw成虫McAb A_3D_3为IgM,k型。应用Dot-ELISA方法,以McAb A_3D_3检测痰卵阳性患者21例和痰卵阴性疑似患者63例血清循环抗原(CAg)),结果痰卵阳性患者CAg阳性率为100％(21/21),痰卵阴性疑似患者CAg阳性率为85.7％(54/63);同法检测45例日本血吸虫病、55例华支睾吸虫病、24例丝虫病、49例肠线虫感染、31例肺结核患者以及93例健康人对照血清均为阴性。结果表明,McAb A_3D_3的特异性及敏感性强,因而在Pw活动性感染和Pw病的早期诊断上均具有应用和推广前景。     

卫氏并殖吸虫TPx基因的克隆、表达和免疫学诊断价值

目的免疫筛选卫氏并殖吸虫成虫c DNA表达文库,克隆并表达卫氏并殖吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx),初步评价其免疫诊断价值。方法用卫氏并殖吸虫病患者的混合血清筛选卫氏并殖吸虫成虫λZAP c DNA表达文库,取阳性噬菌体进行克隆、测序和序列比对分析。将TPx基因全长片段和前端截短片段分别克隆至原核表达质粒pET28a (+)中,构建r Pw TPx (全长型)和r Pw TPx1 (截短型)表达载体。构建的重组蛋白经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。使用蛋白抽提剂、溶菌酶和核酸酶裂解表达细菌,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化r Pw TPx和r Pw TPx1, SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。以r Pw TPx、r Pw TPx1和粗抗原作为检测抗原,间接ELISA法检测36份卫氏并殖吸虫病、 15份华支睾吸虫病、 15份日本血吸虫病、 15份片形吸虫病和15份猪囊尾蚴病的患者血清,以及36份健康人血清,评价该重组蛋白的免疫诊断价值。以健康人血清对照组的平均值加上4个标准差作为阳性判断值。所有数据均采用SAS 9.2软件进行统计学分析。结果克隆的卫氏并殖吸虫TPx基因,经原核表达、纯化,获得其可溶性重组蛋白r Pw TPx和r Pw TPx1,相对分子质量(Mr)分别为25 000和22 000。以r Pw TPx作为检测抗原的ELISA检测结果显示,卫氏并殖吸虫病患者、健康者、华支睾吸虫病患者、日本血吸虫病患者、片形吸虫病患者和猪囊尾蚴病患者血清组的吸光度(A450值)分别为0.150±0.092、 0.036±0.014、 0.043±0.019、 0.047±0.013、 0.060±0.022和0.048±0.021。卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为58.3%(21/36), 36份健康人血清、 15份华支睾吸虫病患者血清、 15份日本血吸虫病患者血清、 15份猪囊尾蚴病患者血清均未检出阳性,15份片形吸虫病患者血清假阳性为2/15。以r Pw TPx1作为检测抗原ELISA检测结果则为0.144±0.092、 0.022±0.009、 0.027±0.015、 0.033±0.022、 0.036±0.015和0.032±0.018。卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为88.9%(32/36),健康人血清未检出阳性,15份华支睾吸虫病患者血清仅1份存在交叉反应,15份日本血吸虫病患者血清假阳性为3份,15份片形吸虫病患者和15份猪囊尾蚴病患者血清假阳性均为2份。重组蛋白r Pw TPx的ELISA检测敏感性为58.3%,特异性为97.9%,总符合率为87.1%;r Pw TPx1则分别为88.9%、 91.7%、 90.9%。r Pw TPx1敏感性高于r Pw TPx (P <0.05)。以成虫粗抗原为检测抗原的ELISA检测结果显示,36份健康者血清A450值为0.012,标准差为0.006。敏感性为100%,特异性为83.3%,总符合率为87.9%,与r Pw TPx-ELISA和r Pw TPx1-ELISA检测的总符合率差异无统计学意义(P> 0.05)。结论筛选并克隆了卫氏并殖吸虫TPx基因,表达并纯化全长型和截短型两种重组TPx抗原,构建的全长型和截短型重组TPx抗原作为人体卫氏并殖吸虫病的免疫诊断抗原具有一定的诊断意义。     

结核和肺吸虫抗体快速联检的鉴别诊断价值

目的探索结核抗体、肺吸虫抗体快速联合检测技术的诊断和鉴别诊断价值。方法结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)抗原、肺吸虫成虫可溶性抗原分别点样在硝酸纤维素膜上,以胶体金-蛋白A结合物为检测标志物,建立结核抗体、肺吸虫抗体联合检测的金标免疫渗滤法(TB/Pw-DIGFA);用TB/Pw-DIGFA检测肺结核病人、肺吸虫病人及健康人血清样本,以敏感性、特异性、灵敏度等指标考核其诊断价值。结果TB/Pw-DIGFA检测涂阳肺结核病人、涂阴肺结核病人和肺吸虫病人抗体的敏感性分别为85.9%(134/156)、83.0%(44/53)和95.6%(22/23);对肺结核病和肺吸虫病的特异性分别为92.6%(100/108)和99.1%(107/108);与TB-Dot平行检测结核病人和健康人群血清共94人份,符合率达96.8%(91/94),经Kappa检验,两者有高度一致性(K=0.935,P<0.001);与ELISA肺吸虫抗体检测试剂盒平行检测肺吸虫病人和健康人群血清共90人份,检测结果完全一致;未发现结核病和肺吸虫病人血清之间有交叉反应。结论TB/Pw-DIGFA诊断肺结核病和肺吸虫病具有较高的敏感性和特异性;该方法一次操作同时完成结核和肺吸虫二项特异性抗体测定,不仅检测效率高而且便于临床医生鉴别诊断。     

小鼠白细胞和免疫血清对卫氏并殖吸虫童虫生物学特性的影响

目的　观察小鼠白细胞及免疫血清协同作用对卫氏并殖吸虫童虫的超微结构以及活力与侵袭力的影响。方法　将小鼠白细胞、免疫血清及卫氏并殖吸虫童虫在体外培养进行抗体依赖细胞介导的细胞毒性 (ADCC)试验 ;分别在倒置显微镜和扫描电镜下观察童虫的活性或超微结构 ,并通过再感染实验检测经ADCC试验后的童虫对新宿主的侵袭能力。结果　卫氏并殖吸虫童虫与小鼠白细胞及免疫血清共同培养后 ,虫体表面出现肿胀、水泡、破损 ,体棘消失、感觉乳突变形或消失等改变 ,但活力与侵袭新宿主的能力不变。结论　小鼠白细胞在免疫血清协同作用下对卫氏并殖吸虫童虫有一定程度的损伤 ,损伤的部位主要在皮层 ,但不影响其活力及侵袭力。     

Preparation of monoclonal antibody against Angiostrongylus cantonensis antigen

Monoclonal antibodies (MAb) against A cantonensis were produced through fusion of immunised spleen cells from BALB/c mice with NS-1 myeloma cells at a ratio of 10:1. The successful fusion rate on the 3rd day of fusion was 90.1%. Ten MAb were characterised, six of which were IgG1 and the remaining four were IgG2a, IgG2b, IgM and IgA respectively. Among 6 IgG1 MAb, four were A. cantonensis-specific, of which three reacted to adult worm antigen only and one reacted to both adult worm and juvenile worm antigens. Two other IgG1 MAb showed cross-reaction with other helminthic antigens of Toxocara canis. Ascaris suum. Paragonimus westermani, Dirofilaria immitis, Anisakis Spp, Gnatostoma Spinigerum and Clonorchis sinensis.     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa基因克隆与表达的研究

目的 :分离 Sj22.6抗原基因 ,构建 Sj22.6表达克隆。方法 :抗体筛选 Sj成虫 cDNA库 ,PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入表达载体 pGEX- 1λt。对重组体进行诱导表达并对表达产物进行 SDS- PAGE和 Western blot分析。结果 :PCR扩增产物为约 930 bp的 DNA条带。亚克隆入pGEX- 1λt,获得两个表达克隆 pGSj6和 pGSj24 ,特异性表达产物为 22.6k Da抗原。重组体的表达方式为分离表达。结论 :从日本血吸虫成虫 cDNA库筛选到 Sj22 .6k Da克隆化基因 ,并构建了表达克隆 pGSj2 4和 pGSj6。     

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。