SV40T/LoxP等外源性基因修饰与肝细胞永生化的研究

目的构建永生化肝细胞系，观察其生长状态及检测其相关生物免疫学特性。方法拟利用基因重组克隆方法构建含有SV40T、EGFP基因片段以及LoxP序列，插入Cre基因片段，采用脂质体转染法将新载体DSV—GFP—Cre—LOX转染至来源于成人原代供肝细胞，建立新型肝细胞体系进行细胞培养；利用转化肝细胞能够表达绿色荧光蛋白特性观察该体系中转化肝细胞的生长状况，最后通过系列生化免疫反应检验转化肝细胞的生化免疫学特性；通过Cre重组酶定点切割导入的SV40T基因使转化肝细胞回复到永生化前的状态，并检测其细胞学相关特性。结果转染SV40T基因的肝细胞具备正常肝细胞生物学特性．且增殖较快，体外易培养。结论新建永生化肝细胞系可以为进一步肝细胞移植提供理想细胞材料作出研究基础．     

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响

目的构建LV5-h Cx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响。方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-h Cx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度。将慢病毒载体LV5-h Cx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFPh Cx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×10¹¹TU·L^-1的重组慢病毒LV5-GFP-h Cx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ。过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力。     

Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达

目的：检测Rab27A与Rab27B在3种人肝癌细胞系及1种永生化肝细胞系中的表达情况,初步研究Rab27A与Rab27B表达对肝癌细胞生物学特性的影响。方法采用RT-PCR及Western blot技术,检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达。结果Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌组织中存在差异性表达。 Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达明显强于1种人永生化肝细胞系;Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均明显表达但无显著差异。结论 Rab27A与Rab27B与原发性肝癌密切相关,可以为临床采取合理诊断措施提供有效的参考依据。     

Construction of p100 Knock Down Stable HepG2 Cell Line with a p100 shRNA Expression Lentiviral System

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系.方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建p LKO.3G-p1001慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定.将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒.运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果.结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株.慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光,Western blot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系.     

PC12细胞SLC6A4基因沉默稳转细胞系的建立及SLC6A4基因沉默对缺氧PC12细胞凋亡的影响

目的 构建SLC6A4基因RNA干扰（RNAi）-短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,建立慢病毒介导沉默SLC6A4基因的PC12细胞稳转细胞系,检测SLC6A4基因沉默对缺氧诱导的细胞凋亡的影响。方法 设计合成3条针对SLC6A4基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,在293T细胞中共转染进行慢病毒包装。转染大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,荧光显微镜观察GFP荧光,筛选最佳shRNA干扰序列,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR方法检测SLC6A4基因的表达,Western blot方法检测蛋白5-HTT的表达变化,流式细胞术检测沉默SLC6A4基因对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果 成功构建SLC6A4-shRNA慢病毒载体并转染PC12细胞,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞内SLC6A4基因和蛋白表达明显降低（P<0.01）,证实慢病毒载体能够有效沉默SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。结论 通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默PC12细胞SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。     

以HIF2α为靶点的化合物筛选的细胞模型构建

目的 建立稳定表达血管内皮生长因子A（VEGFA）启动子区5×缺氧反应元件（5×HRE）和萤光素酶（Luc）报告基因的人肾透明细胞癌（786-O）单克隆细胞系,构建以缺氧诱导因子2α（HIF2α）为靶点的化合物筛选的细胞模型,并对其应用加以初步验证。方法 采用基因重组技术,构建含有VEGFA启动子区5×HRE以及Luc报告基因的慢病毒载体,并感染786-O细胞,经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的786-O-5×HRE-Luc细胞系;采用等浓度梯度稀释获得单克隆细胞系,运用HIF2α抑制剂PT2385和PT2399处理,检测Luc活性变化,筛选对PT2385和PT2399反应更灵敏的单克隆细胞系。结果 通过基因测序鉴定,VEGFA启动子区5×HRE和Luc报告基因慢病毒表达载体构建成功,经过嘌呤霉素（Puro）筛选获得稳定表达Luc的786-O-5×HRE-Luc细胞;PT2385和PT2399可剂量依赖性的降低细胞Luc的活性;得到对PT2385和PT2399反应灵敏的单克隆细胞系。结论 建立了786-O-5×HRE-Luc稳定表达5×HRE和Luc报告基因细胞系,为高通量筛选靶向HIF2α的药物提供一类新的细胞模型。     

磷酸化cAMP反应元件结合蛋白对发育期人牙乳头细胞增殖和分化的影响

目的 构建CBP抑制表达慢病毒载体,探讨CBP有效表达沉默后对体外培养人牙乳头细胞(human dental papilla cells,HDPC)的增殖及分化影响.方法 利用基因重组技术构建重组慢病毒建立牙乳头细胞沉默稳转细胞,采用CCK-8检测细胞增殖的变化,采用检测分化相关蛋白的表达评价CBP对HDPC分化能力的影响.结果 测序结果提示成功构建四组人CBP基因的重组慢病毒;转染HDPC后,通过RT-PCR和蛋白质印迹法筛选获得有效靶点的重组慢病毒;CCK-8检测结果表明HDPC在CBP表达下调后增殖活性受到抑制;慢病毒介导CBP沉默后影响了HDPCs相关分化蛋白ColI、OCN、OPN的表达,较对照组显著下调(P＜0.05);牙乳头细胞的ALP活性在转染重组慢病毒后5,7,14 d后显著降低(P＜0.05);结论 成功构建了高效CBP抑制表达载体,CBP沉默可抑制HDPCs的增殖和分化.     

p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Westernblot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。     

雌激素受体α基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的:构建雌激素受体(ER)α基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度.方法:针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCsil-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生 shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用shERα-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/mL.结论:成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了基础.     

MLH1 R217C/BRAF V600E 突变型家族性甲状腺乳头状癌永生化细胞系的建立及鉴定

摘要： 目的 建立家族性甲状腺乳头状癌 （FPTC） 永生化细胞系, 为研究家族性非髓样甲状腺癌 （FNMTC） 提供新的途径。方法 选取 FPTC 患者的肿瘤标本, 采用消化法分离原代细胞。使用改良的 DMEM/F12 培养基, 添加促甲状腺激素 （TSH）、 三碘甲状腺原氨酸 （T3）、 表皮细胞生长因子 （EGF） 及氢化可的松等进行培养。在原代细胞早期分 2种方式导入外源基因 SV40T/TERT 用于诱导永生化。利用 RT-PCR 检测甲状腺过氧化物酶（TPO）、 甲状腺球蛋白（TG）、 促甲状腺激素受体 （TSHR）、 钠/碘共同转运体（NIS） 等基因的表达, 同时利用免疫荧光技术检测 TPO 及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）蛋白的表达。提取该患者外周血 DNA, 进行突变基因的检测。提取细胞基因组 PCR 扩增后测序, 进行突变基因的检测。结果 分离的 FPTC 原代细胞呈梭形或不规则多角形贴壁生长; 细胞生长 6 个月, 转染 SV40T 组（标记为 FPTC-S）传代至 p26, FPTC 细胞传代至 p23, 转染 SV40T+hTERT 组（标记为 FPTC-ST）传代至p19, 细胞增殖能力较好; FPTC-S 与 FPTC-ST 细胞均能够在基因水平稳定表达 TPO、 TG 与 TSHR; 患者外周血中存在 MLH1 R217C 胚系突变; 原代细胞存在 BRAF V600E 突变; 原代细胞及永生化的细胞系中均存在 MLH1 R217 基因突变。结论 本研究初步建立了 FPTC 永生化细胞系, 且该细胞系中存在 MLH1 R217C 及 BRAF V600E 突变, 该细胞系将为研究以上突变及其相互作用关系提供研究模型。