豆蔻明对TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信号通路的调节作用

目的探讨豆蔻明(cardamonin,CDN)对RAW264.7小鼠巨噬细胞Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/My D88/NF-κB/i NOS信号通路的调节作用。方法利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理RAW264.7细胞建立炎性细胞模型并分组:正常对照组(Vehicle组)、模型组(LPS组)和药物处理组(LPS+CDN组);CCK-8方法检测细胞活力,Griess法检测细胞培养上清一氧化氮(nitric oxide,NO)含量,RT-PCR检测诱导型NO合成酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-ɑ、白介素(interleukin,IL)-1β和IL-6的mRNA表达,Western blot检测i NOS、TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)phosphorylated(p)-p65、inhibitorκBα(IκBα)和p-IκBα的蛋白表达。结果1~50μmol·L~(-1)豆蔻明对RAW264.7细胞没有毒性,但可以剂量依赖性抑制LPS诱导的NO分泌和i NOS、COX-2、MCP-1、TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表达,25μmol·L-1豆蔻明可下调LPS诱导的i NOS、TLR4、My D88、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达及抑制IκBα降解。结论豆蔻明通过抑制TLR4/My D88/NF-κB/i NOS信号通路从而抑制NO的产生。     

知母皂苷通过调节NF-κB-iNOS-NO信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞功能

目的研究知母皂苷(SAaB)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞功能的影响,以及对NF-κB-诱导型一氧化氮合酶(iNOS)-NO信号通路的调节。方法以LPS刺激RAW264.7细胞构建体外炎症细胞模型,采用Griess法和ELISA法分别检测SAaB干预下,RAW264.7炎症细胞中的NO、iNOS、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的含量;Western blot检测RAW264.7细胞NF-κB p65蛋白的表达水平。结果 RAW264.7细胞在LPS(10 mg·L~(-1))诱导下,NO、iNOS、TNF-α、IL-6的含量以及NF-κB p65蛋白表达水平与正常对照组比较均明显增高。SAaB(0.3、3、30 mg·L~(-1))可明显降低RAW264.7炎症细胞中NO、iNOS、TNF-α和IL-6的含量(P<0.01),且明显下调NF-κB p65的蛋白表达水平(P<0.01)。结论 SAaB可通过调节NF-κB-iNOS-NO信号通路,抑制LPS诱导的RAW264.7细胞功能。     

热休克蛋白70激动剂SW02对脂多糖诱导的巨噬细胞iNOS表达的调控及机制

目的观察热休克蛋白70(Hsp70)激动剂SW02对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及一氧化氮(NO)生成的作用,并探讨其作用机制。方法采用LPS诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症模型,将细胞随机分为DMSO组、DMSO+LPS(1 mg·L~(-1))组、SW02组和SW02+LPS(1 mg·L(-1))组。Western blot法测定蛋白表达;Griess试剂法测定NO含量;实时定量PCR法测定iNOS mRNA表达;染色质免疫共沉淀法(ChIP)检测核因子κB(NF-κB)与iNOS启动子结合能力变化。结果 SW02明显抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS蛋白、mRNA表达和NO释放(SW02+LPS组iNOS表达量和NO生成量明显低于DMSO+LPS组,P<0.01或P<0.05);SW02不影响由LPS诱导的RAW264.7细胞κB-α抑制子(IκB-α)降解(SW02+LPS组IκB-α表达量与DMSO+LPS组比差异无显著性,P>0.05)和NF-κB入核(SW02+LPS组细胞质、细胞核NF-κB表达量与DMSO+LPS组比差异无显著性,P>0.05);SW02明显抑制由LPS诱导的NF-κB与iNOS启动子结合(SW02+LPS组NF-κB与iNOS启动子结合量明显低于DMSO+LPS组,P<0.05)。结论 SW02抑制巨噬细胞iNOS表达和NO生成,其机制可能与抑制NF-κB与iNOS启动子结合有关。     

淫羊藿次苷Ⅱ通过调节IKK/IκB/NF-κB信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症反应

目的研究ICSⅡ对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞炎症反应的作用。方法体外分离新生SD大鼠脑皮质组织提取原代星形胶质细胞并进行培养。将星形胶质细胞分为空白组、空白+ICSⅡ高浓度组、模型组、模型+ICSⅡ低浓度组、模型+ICSⅡ中浓度组、模型+ICSⅡ高浓度组、模型+地塞米松组。ICSⅡ(5,10,20μmol·L-1)或DSMX(1μmol·L-1)预处理星形胶质细胞1 h后,继续与LPS共同作用24 h。采用MTT法检测ICSⅡ作用于星形胶质细胞的安全浓度范围,确定安全浓度后再观察ICSⅡ对LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应的影响;采用ELISA法检测星形胶质细胞中TNF-α,IL-1β,NO,Aβ1-40和Aβ1-42的水平;采用Western蛋白免疫印迹技术检测COX-2,i NOS,IκB-α,NF-κB(p65)(胞核),NF-κB(p65)(胞质)和BACE1的蛋白表达,以及NF-κB(p65)、IKK-α和IKK-β磷酸化水平;采用分子对接技术模拟ICSⅡ与BACE1蛋白的结合。结果 ICSⅡ(0～50μmol·L-1)对星形胶质细胞无毒性作用。模型组较空白组星形胶质细胞中TNF-α,IL-1β和NO水平均显著上升(P<0.05);细胞炎症通路蛋白COX-2,i NOS,NF-κB(p65)(胞核)及BACE1表达升高(P<0.05);IκB-α和NF-κB(p65)(胞质)表达显著降低(P<0.05);NF-κB(p65),IKK-α和IKK-β的磷酸化水平明显上升(P<0.05)。给予ICSⅡ能够明显降低TNF-α,IL-1β和NO水平(P<0.05)。此外,ICSⅡ显著下调炎症相关蛋白COX-2,i NOS,NF-κB(胞核)及BACE1的表达(P<0.05),明显上调NF-κB(胞质)和IκB-α蛋白表达(P<0.05)。同时,明显降低NF-κB(p65),IKK-α和IKK-β的磷酸化水平(P<0.05),对LPS诱导的IκB-α降解、NF-κB活化及细胞核易位均具有显著的抑制作用。结论本研究条件下,ICSⅡ通过调节IKK/IκB/NF-κB信号通路发挥其对LPS诱导的星形胶质细胞炎症损伤的保护作用。     

苹果多酚对脂多糖刺激的RAW264.7细胞COX-2/PGE2和iNOS/NO表达的研究

目的 研究苹果多酚(APE)对脂多糖(LPS)诱发的RAW264.7细胞炎症COX-2/PGE2和iNOS/NO表达的抑制作用.方法 采用APE干预LPS刺激的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7,然后用Griess Reagent法和ELISA法检测细胞分泌的一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的水平,并且采用RT-qPCR和Western blotting技术检测APE对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)水平的影响以及核转录因子(NF-κB)的蛋白表达.结果 APE能显著抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中NO、PGE2的含量,下调iNOS及COX-2的表达及NF-κB的磷酸化.结论 APE通过下调NF-κB的活性及iNOS与COX-2表达而发挥抗炎作用.     

原花青素对脂多糖诱导RAW2647细胞COX-2酶活性、mRNA及蛋白表达的影响

目的探讨原花青素对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞COX-2酶活性及蛋白表达的影响。方法放射免疫法检测COX-2酶活性，RT-PCR检测COX-2 mRNA表达，Western blotting检测COX-2蛋白表达。结果原花青素(0.8，4和20 mg·L^-1)不影响LPS诱导RAW264.7细胞COX-2酶活性，可下调LPS诱导RAW264.7细胞COX-2 mRNA表达；原花青素(4和20 mg·L^-1)下调LPS诱导RAW264.7细胞COX-2蛋白表达。结论原花青素不影响LPS诱导RAW2647细胞COX-2酶活性，但对LPS诱导RAW264.7细胞COX-2 mRNA及蛋白表达抑制作用明显。     

八肽胆囊收缩素抑制LPS诱导的RAW264.7细胞AP-1活性及IL-6表达

目的研究八肽胆囊收缩素(CCK-8)对LPS诱导RAW264.7细胞IL-6表达的影响及相关机制。方法用ELISA及RT-PCR法检测RAW264.7细胞IL-6蛋白及mR-NA表达;用EMSA方法检测RAW264.7细胞AP-1 DNA结合活性。结果①LPS可时间依赖性的诱导RAW264.7细胞IL-6蛋白及mRNA表达;②10-10 mol.L-1 CCK-8对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6表达无明显影响;10-8、10-6 mol.L-1 CCK-8浓度依赖性地抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6表达;③10-10 mol.L-1 CCK-8未影响LPS诱导的AP-1活性,10-8、10-6 mol.L-1 CCK-8浓度依赖性地抑制了LPS诱导的AP-1活性。结论 CCK-8通过抑制AP-1 DNA结合活性而抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6表达,这可能是CCK-8发挥抗炎作用的信号转导机制之一。     

穿琥宁抗炎作用的血红素加氧酶-1的信号转导机制

目的初步探讨穿琥宁抗炎作用的信号转导机制。方法用WST-8细胞计数试剂盒检测穿琥宁的细胞毒性;用IN Cell Analyzer 2000活细胞成像系统及组成型增强表达绿色荧光蛋白偶联NF-κBP65(EGFP-NF-κBP65)融合蛋白的CHO细胞和EGFP偶联促分裂原活化蛋白激酶APk2(EGFP-MAPK-APk2)融合蛋白的BHK细胞观察穿琥宁对白细胞介素1β(IL-1β)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导NF-κBP65核转位及脂多糖(LPS)诱导的P38MAPK下游分子MAPK-APk2核转位的影响;Western印迹法检测穿琥宁和血红素加氧酶-1(HO-1)特异性抑制剂锌原卟啉(ZnPP)对RAW264.7细胞HO-1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶2(COX-2)表达的影响;Griess反应和ELISA法测定穿琥宁对RAW264.7细胞一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)生成的影响。结果穿琥宁3～100μmol·L-1作用24 h对RAW264.7细胞无细胞毒性。穿琥宁不能抑制由IL-1β诱导的NF-κBP65核转位和LPS诱导的MAPK-APk2核转位,对TNF-α诱导的NF-κBP65核转位有较弱的抑制作用,抑制率为20%,无明显浓度效应关系。穿琥宁3,10,30和100μmol·L-1作用4 h能诱导RAW264.7细胞HO-1表达,穿琥宁100μmol· L-1作用6 h显著抑制IL-1β诱导的COX-2表达和PGE2产生,作用12 h抑制iNOS表达和NO产生。HO-1活性抑制剂ZnPP能部分逆转穿琥宁的上述作用。结论穿琥宁的抗炎作用可能主要通过HO-1信号转导,继而抑制iNOS和COX-2的表达及NO和PGE2的产生。对NF-κB信号传导系统的调节作用尚不清楚。     

蟛蜞菊内酯对脂多糖诱导RAW264.7细胞环氧化酶2、NO及TNF-α的影响

目的:研究蟛蜞菊内酯对脂多糖(lipopo-lysaccharide,LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞环氧化酶2(COX-2)、NO及TNF-α的作用。方法:ELISA方法检测0.2、2、20μmol/L不同浓度蟛蜞菊内酯对终浓度为10μg/mL LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF-α、NO及前列腺素E2(PGE2)的影响,Western blot方法检测蟛蜞菊内酯对LPS诱导COX-2酶蛋白表达的影响。结果:LPS能够明显诱导小鼠RAW264.7细胞产生的COX-2酶蛋白,蟛蜞菊内酯低中高3个浓度均能抑制LPS诱导产生的COX-2酶蛋白表达。PGE2可以被LPS诱导增加,与空白组比有显著差异。蟛蜞菊内酯低中高3个浓度均能抑制LPS诱导产生的PGE2、NO和TNF-α,呈现剂量依赖性。结论:蟛蜞菊内酯抗炎的作用机制可能为抑制COX-2的蛋白表达,进而抑制PGE2的生成,也可能与抑制NO和TNF-α生成有关。     

八肽胆囊收缩素通过p38MAPK通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达

目的研究八肽胆囊收缩素(CCK-8)对LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β表达的影响及相关机制。方法用ELISA及RT-PCR法检测RAW264.7细胞IL-1βmRNA及蛋白表达;用Western blot检测RAW264.7细胞p38 MAPK的磷酸化水平。结果①LPS可时间依赖性的诱导RAW264.7细胞IL-1βmRNA及蛋白的表达,分别于刺激后3 h及6 h达到高峰;②10-10 mol.L-1 CCK-8对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达无影响;10-8、10-6 mol.L-1CCK-8浓度依赖性地抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达;③10-10 mol.L-1 CCK-8未影响LPS诱导的p-p38MAPK水平,10-8、10-6 mol.L-1 CCK-8浓度依赖性地抑制了LPS诱导的p-p38 MAPK水平;④p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达,与CCK-8共同作用后,抑制作用进一步加强。结论 CCK-8通过抑制p38 MAPK磷酸化而抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达,这可能是CCK-8发挥抗炎作用的信号转导机制之一。     

黄芩素对2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠实验性肠炎的作用和机制

目的探讨黄芩素对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠肠炎实验模型的作用及机制。方法将BALB/c小鼠随机分成3组(n=10):正常对照组、模型组(TNBS)和黄芩素组(TNBS+黄芩素20 mg·kg-1)。黄芩素组于造模前2 d ig给予黄芩素,每天1次,共9 d。测量结肠长度,并取结肠组织进行HE染色,进行组织损伤和炎症细胞浸润评分;ELISA测定结肠组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。体外制备细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7炎症细胞模型,黄芩素(10,25和50 mmol·L-1)给药干预,Griess试剂法测定上清中一氧化氮(NO)含量;荧光定量PCR检测炎症介质TNF-α、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、诱导型NO合酶(i NOS)、环氧合酶2(COX-2)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)m RNA表达;Western蛋白印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/NF-κB(PI3K/AKT/NF-κB)通路磷酸化蛋白(p-PI3K,p-AKT,p-p65和p-IκBa)表达。结果与正常对照组相比,模型组小鼠结肠缩短,组织病理损伤,炎症细胞浸润,组织TNF-α含量增高;黄芩素给药组上述症状得到显著改善(P<0.05)。与细胞对照组相比,LPS模型组细胞NO分泌、炎症介质(TNF-α,IL-6,IL-1β,i NOS,COX-2和MCP-1)m RNA表达及PI3K/AKT/NF-κB通路磷酸化蛋白表达均增高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,黄芩素给药组上述指标均降低(P<0.05,P<0.01)。结论黄芩素可减轻TNBS诱导的小鼠实验性肠炎的症状,作用机制可能与抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的激活从而抑制炎症介质的表达和减少炎症因子释放有关。     

壮药三七姜醇提物及含药血清对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的抗炎作用及机制

目的 研究壮药三七姜醇提物及含药血清对脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞炎症的抗炎作用及机制。方法 将三七姜醇提物（75.35 g/kg）或纯净水灌胃大鼠以制备含药血清或空白血清。以RAW264.7细胞为研究对象，将细胞分为正常对照组，LPS组（1μg/mL），三七姜醇提物高、中、低剂量组（50、25、12.5μg/mL）,4%或15%空白血清组，4%或15%空白血清+LPS组，4%或15%含药血清组，4%或15%含药血清+LPS组，按相应条件培养24 h后，检测各组细胞活力和细胞中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6含量，以及Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)mRNA表达水平，一氧化氮合酶（NOS）、环氧化酶2(COX-2)蛋白表达水平。结果 各组细胞培养24 h后，细胞活力差异无统计学意义。与正常对照组比较，LPS组细胞中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，TLR4、NF-κB mRNA表达水平和NOS、COX-2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。与4%或15%空白血清组比较，4%或15...     

鹅去氧胆酸抗脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应作用及机制

目的研究鹅去氧胆酸(CDCA)抗脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的作用及其机制。方法 BV2细胞与CDCA 25～100μmol·L~(-1)预孵育2 h,加LPS 200 mg·L~(-1)继续培养22 h,采用Griess试剂法检测一氧化氮(NO)含量;Western印迹法检测细胞内环氧合酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平;RT-PCR法检测细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL~(-1)β和G蛋白偶联受体5(TGR5)mRNA表达水平。BV2细胞与CDCA 25～100μmol·L~(-1)预孵育2 h,加入LPS 200 mg·L~(-1)继续培养1 h,Western印迹法检测NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察NF-κB入核情况。结果与正常对照组相比,模型组培养基中NO含量显著增加(P<0.01);COX-2和iNOS蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01);TNF-α,IL-6和IL~(-1)βmRNA表达显著上调(P<0.01);TGR5 mRNA表达显著下调(P<0.01);并且NF-κB,IκBα和AKT磷酸化水平显著增加(P<0.05,P<0.01),NF-κB入核增多。与模型组相比,CDCA显著减少培养基中NO含量(P<0.01),降低COX-2和iNOS蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01);显著下调TNF-α,IL-6和IL~(-1)βmRNA表达(P<0.01);显著上调TGR5 mRNA表达(P<0.01)。与模型组相比,CDCA显著降低NF-κB,IκBα和AKT磷酸化水平(P<0.05,P<0.01),并观察到NF-κB核转位减少现象。结论 CDCA可显著抑制LPS诱导BV2细胞炎症反应,其作用机制可能与激活TGR5、抑制Akt/NF-κB信号通路相关。     

基于Keap1/Nrf2/HO-1通路汉黄芩素7-O-β-D-乙基葡萄糖醛酸苷体外抗氧化应激作用研究

目的 探讨汉黄芩素7-O-β-D-乙基葡萄糖醛酸苷(WODE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的抗氧化应激作用及机制。方法 MTS法检测WODE(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0μmol·L^-1)对RAW264.7细胞活力的影响;体外培养RAW264.7细胞,WODE(10、20、40μmol·L^-1)或地塞米松(1μmol·L^-1,阳性药)预处理1 h,再给予LPS刺激24 h(造模过程不再加药),对照组不加LPS和受试物,模型组只给予LPS刺激;荧光探针检测胞内活性氧(ROS)水平;Griess反应测定细胞上清液中NO生成量;ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞内诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、醌氧化还原酶1(NQO-1)、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)的mRNA表达水平;Western blot...     

穿心莲内酯对巨噬细胞环氧化酶2及其产物表达的影响

目的研究穿心莲内酯对巨噬细胞环氧化酶2(COX-2)表达及其主要产物前列腺素E2(PGE2)生成的影响。方法取生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,加入不同浓度的穿心莲内酯(终浓度1、10、50μmol/L)进行预干预,1h后再加入脂多糖(LPS,终浓度1μg/mL)刺激,并设空白组和穿心莲内酯单独作用组作为对照组。取培养18h细胞上清,用Elisa法检测PGE2生成量;取培养24h细胞,提取总蛋白,用WesternBlot法检测穿心莲内酯对COX-2蛋白表达的影响。结果 LPS可以显著诱导RAW264.7细胞COX-2表达和PGE2的生成,与对照组比较P<0.01;穿心莲内酯预干预可以抑制LPS诱导的COX-2蛋白表达,下调PGE2的生成。结论穿心莲内酯可通过降低LPS诱导的巨噬细胞COX-2表达和PGE2生成,发挥抗炎作用,这可能是其抗炎的作用机制之一。     

鱼腥草素钠对脂多糖诱导单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨鱼腥草素钠(SH)对脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用及其机制。方法 实验分为空白对照组(等体积培养基)，模型组(等体积培养基)，SH低、中、高剂量组(1.25,5,10μmol/L)，以含不同浓度SH的常规培养基培养细胞2 h，后4组细胞加入LPS继续培养24 h。收集细胞上清液，测定一氧化氮(NO)水平，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及前列腺素E₂(PGE₂)的水平；提取细胞总蛋白，采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)蛋白及核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白(NF-κB-P-P65蛋白和P-IκB-α蛋白)的表达水平。结果 与模型组比较，SH中、高剂量组细胞NO水平显著降低，SH低、中、高剂量组细胞TNF-α,IL-6,PGE₂水平和COX-2,NF-κB-P-P65,P-IκB-α蛋白表达水平均显著降低，SH中、高剂量组细胞iNOS蛋白表达水平显著降低...     

蛇六谷葡苷露聚糖对小鼠巨噬RAW264.7细胞免疫调节作用及机制研究

目的探讨蛇六谷葡苷露聚糖(KGM)对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用及机制。方法采用MTT法检测KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞存活率的影响,观察巨噬细胞形态的变化;采用吞噬中性红和流式细胞仪测FITC-dextran的方法检测KGM处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性;采用Griess法测定NO,ELISA法检测细胞培养液中IL-6,IL-1β和TNF-α等细胞因子的含量;采用qRT-PCR法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7相关基因iNOS,IL-6,TNF-α,IL-1β,TLR4,My D88,TRAF-6,TRAM和NF-κB等的表达。结果 KGM在50～400 mg·L~(-1)对小鼠巨噬细胞RAW264.7没有细胞毒性。KGM处理24 h后,RAW264.7细胞体积增大,胞内颗粒小泡增多,呈不规则多边形,部分细胞伸出伪足,表现为典型的激活态;中性红吞噬实验和流式测定FITC-dextran实验结果表明,KGM 50～200 mg·L~(-1)能显著提升小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性,与对照组相比,KGM 100 mg·L~(-1)分别使细胞吞噬活性提高101.4%和404.3%。Griess法检测表明,KGM能显著增加小鼠巨噬细胞RAW264.7合成和释放NO,其中KGM100 mg·L~(-1)处理组细胞NO含量与LPS 5 mg·L~(-1)作用相当,与对照组相比,NO含量提高318.1%。ELISA检测表明,KGM 50～200 mg·L~(-1)能诱导RAW264.7细胞分泌IL-6,TNF-α和IL-1β等细胞因子,与对照组相比,KGM 100 mg·L~(-1)明显使细胞因子分泌量分别增加415.5%,158.6%和458.0%(P<0.01)。qRT-PCR的结果显示,与对照组相比,KGM组IL-6,i NOS,TNF-α,IL-1β,TLR4,My D88,TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平升高(P<0.05),表明KGM可以激活小鼠巨噬细胞RAW264.7中的核转录因子NF-κB和TLR4。结论 KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞具有免疫调节活性,能够显著提升小鼠细胞RAW264.7的吞噬能力,促进分泌与释放NO和TNF-α等相关细胞因子,推测可能是通过激活TLR4/My D88/NF-κB信号通路发挥免疫调节作用。     

白杨素对TNF-α诱导慢性暴露TGF-β卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成的影响

目的研究白杨素对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导慢性暴露转化生长因子-β(TGF-β)卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成的影响,并探讨其作用机制是否涉及下调NF-κB(p65)蛋白表达。方法 TNF-α(10μg·L~(-1))处理TGF-β(5μg·L~(-1))预暴露12 d的卵巢癌OVCAR-3细胞24 h,球形成率测定法检测不同浓度(5.0、10.0、20.0μmol·L~(-1))白杨素对球形成率的影响;Western blot检测NF-κB(p65)蛋白表达;NF-κB(p65)siRNA转染探讨作用机制。结果 TNF-α(10μg·L~(-1))联合慢性暴露TGF-β(5μg·L~(-1))处理增高OVCAR-3细胞系球形成率。白杨素能有效地拮抗致炎因子诱导卵巢癌细胞自我更新作用,呈剂量依赖性(P<0.05),并伴随着NF-κB(p65)蛋白表达下调。与对照siRNA相比,NF-κB(p65)siRNA转染OVCAR-3细胞NF-κB(p65)蛋白表达下调,并明显增强白杨素抑制球形成作用。结论下调NF-κB(p65)蛋白表达参与白杨素抑制TNF-α(10μg·L~(-1))联合慢性暴露TGF-β(5μg·L~(-1))处理诱导卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成作用。     

STAT5通路抑制剂匹莫齐特对RAW264.7细胞炎症模型NO和iNOS表达的影响

目的:研究STAT5通路抑制剂匹莫齐特对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶(i NOS)表达的影响。方法:取对数生长期RAW264.7细胞,分为空白对照组、药物对照(匹莫齐特10μmol/L)组、模型(LPS 1μg/ml)组和匹莫齐特低、中、高浓度(2.5、5、10μmol/L)组,给予LPS前30 min给予匹莫齐特,继续培养24 h。采用Griess法检测各组细胞培养液上清中NO的含量;实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测i NOS m RNA表达;Western blot法检测i NOS和磷酸化STAT5(p-STAT5)的蛋白表达。结果:与空白对照组比较,模型组细胞中NO含量、i NOS m RNA和蛋白表达、p-STAT5/STAT5均增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,匹莫齐特中、高浓度组细胞中NO含量、i NOS m RNA和蛋白表达、p-STAT5/STAT5均降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论:STAT5通路抑制剂匹莫齐特可通过抑制细胞中i NOS m RNA和蛋白的表达而抑制NO的释放。     

山萘酚对脂多糖诱导RAW264.7细胞中COX-2和iNOS表达及产物生成的影响

目的探讨山萘酚对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导RAW 264.7细胞COX-2及iNOS表达的影响。方法四氮唑盐法(monote-trazolium test,MTT)检测山奈酚对RAW264.7细胞生长增殖的影响,放射免疫测定法(RIA)检测山萘酚对PGE2和NO生成的影响,免疫印迹法(western blotting)检测COX-2及iNOS蛋白的表达。结果山萘酚抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞PGE2和NO的生成,同时下调LPS诱导的RAW 264.7细胞COX-2及iNOS蛋白的表达。结论山萘酚抑制2个诱导酶COX-2和iNOS的表达,从而减少炎性产物PGE2和NO的生成,这可能是山萘酚抗炎的机制之一。