神经干细胞分化过程中GAP-43基因的表达及其意义

目的:探讨神经干细胞(NSC)在分化过程中生长相关蛋白43(GAP-43)基因的表达及其意义。方法:NSC提取于新生鼠的海马区,经培养及Nestin免疫细胞化学鉴定,用RT-PCR和免疫组化方法观察GAP-43基因在NSC分化过程中不同时间点的表达。结果:GAP-43mRNA在NSC处于克隆球阶段未检测到其表达,开始分化12h可检测到其低表达,并逐渐升高,3d表达量达到高峰,5d表达量下降。GAP-43最初在NSC分化1d的胞质内表达并逐渐升高,5d表达增强,于细胞的突起中明显,7d时GAP-43反应减弱并逐渐消失。结论:在神经干细胞分化为神经元过程中GAP-43基因参与引导突起的生长并发挥重要作用。     

神经干细胞分化过程中NgR表达的变化

目的 检测大鼠脊髓来源神经干细胞分化过程中NgR的表达情况.方法 悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞,检测神经球及其分化后不同时间点、不同细胞亚型的NgR表达情况.结果 神经干细胞分化前和分化第1天所有细胞都显著表达NgR,NgR表达阳性率在分化第2天降至82.1%±4.14%,分化第3天降至最低点35.3%±4.31%.分化后形成的细胞中只有神经元和少量未分化细胞表达NgR,星形胶质细胞和少突胶质细胞不表达NgR.结论 在神经干细胞分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞的过程中NgR基因表达被关闭,而在其分化成神经元的过程中则始终表达NgR.     

Notch1基因在神经干细胞分化过程中的表达

目的　研究Notch1基因在全反式维甲酸 (all trans retinoic acid ,ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用。方法　用 1 μmol/L的ATRA在体外诱导人胚胎神经干细胞 ,诱导 7d后 ,做神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificendase,NSE)免疫荧光染色 ,计数分化为神经元的比例。于诱导前、诱导 3d和诱导 7d ,提取细胞的总RNA。用半定量RT PCR法检测Notch1基因的表达。结果　与对照组相比 ,ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 (P <0 .0 1 )。Notch1基因在ATRA诱导后明显下调 (P <0 .0 0 1 )。结论　ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 ,Notch1基因在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起负调控作用。     

神经干细胞分化过程中溶酶体与微管蛋白相关性研究

目的探讨神经干细胞向神经元定向分化过程中溶酶体和微管蛋白(β-tublin)的相关性.方法采用细胞培养技术、荧光免疫细胞化学技术以及共焦激光扫描显微镜技术对神经干细胞向神经元定向分化过程中溶酶体和微管蛋白的分布变化进行观察.结果在神经干细胞向神经元定向分化的不同时期,存在着溶酶体与微管蛋白的分布变化,CLSM扫描显示两者在分化初期以核周附近分布明显,随神经元的成熟散在分布于胞质中及突起内.结论在神经干细胞向神经元定向分化过程中溶酶体与微管蛋白关系密切,共同参与细胞内物质的运输.     

白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体的构建及其在肝干细胞分化研究中的应用

目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向.方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbDsRed),并利用报告载体标记的肝干细胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)观察了悬浮培养时LEPCs的分化去向.结果:白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向.结论:双色荧光蛋白报告载体的成功构建为研究LEPCs的分化、筛选可诱导LEPCs定向分化的分子提供了便捷的工具.     

神经干细胞分化前后基因表达变化的DNA微阵列分析

目的：了解神经干细胞分化前后的差异表达基因，为神经干细胞的分化调控提供基础研究资料。方法：利用细胞培养、DNA微阵列技术等，检测了神经干细胞分化前后的差异表达基因。结果：检测到了1000多个差异表达基因，其中明显上调的基因138个，明显下调的基因179个，基因种类很多如细胞周期相关基因、发育与分化相关基因、受体与通道相关基因、细胞骨架相关基因、生长因子相关基因、原癌基因和抑癌基因、转录和翻译调节基因、ESTs、代谢调节、蛋白运输相关基因等。结论：大量基因参与了神经干细胞的分化调控，其确切调控机制，还有待于进一步深入研究。     

Ephrin B2基因在维甲酸诱导神经干细胞分化过程中的表达

目的　研究EphrinB2基因在全反式维甲酸诱导人胚胎神经干细胞的分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用。方法　用 1μmol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞 ,诱导 7d后 ,做NSE免疫荧光染色 ,计数分化为神经元的比例。于ATRA诱导前、诱导 3d和诱导 7d ,提取细胞的总RNA。用半定量RT PCR法检测EphrinB2基因的表达情况。结果　与对照组相比 ,全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 (P <0 .0 1)。EphrinB 2基因在维甲酸诱导后明显上调 (P <0 .0 0 1)。结论　EphrinB2基因在全反式维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起正调控作用 ,EphrinB2基因与神经元的分化关系密切。     

BMPs 在中枢神经系统发育和神经保护中的作用

骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins,BMPs）是转化生长因子-β（transforming growth factor -β）超家族的成员,现已经发现 BMPs 很多亚型 BMP 分子在神经系统的不同区域呈持续性表达,但是表达在空间和时间具有差异性,提示不同亚型 BMPs 的功能在神经系统也存在差异。本文主要就 BMPs 在中枢神经系统发育中的作用和神经保护功能作一综述。     

Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用

目的 探究Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用,揭示其对神经管发育的影响。 方法 免疫荧光检测神经干细胞标记物——巢蛋白(Nestin)、神经元标记物——神经丝蛋白(NF)、星型胶质细胞标记物——神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞标记物——半乳糖脑苷脂(GALC)及Notch1在上述细胞中的分布。Western blotting检测神经干细胞中Notch1、NF、GFAP、GALC分别在普通分化培养基和全反式维甲酸培养基(ATRA)中1、3、5、7 d的含量。神经干细胞分为4组:将普通分化培养基设为A组,普通分化培养基+DMSO组设为B组,普通分化培养基+DMSO+25 μmol/L γ-内分泌酶抑制剂(γSI)组设为C组,普通分化培养基+DMSO+50 μmol/L γSI设为D组,Western blotting检测各组细胞中Notch1含量。 结果 免疫荧光鉴定Nestin、NF、GFAP、GALC呈阳性,且在上述细胞胞膜上及胞质中有Notch1存在。普通分化培养基中Notch1在第5天较第1天明显增加,NF在第5天较第3天明显降低,GFAP与GALC含量在第5天较第1天明显下降。加入ATRA的普通分化培养基中,Notch1在第7天较第1天明显减少,而NF、GFAP、GALC在第7天较第1天明显增加。加入γSI后,Notch1胞内段NICD含量明显降低。 结论 Notch1信号通路抑制神经干细胞分化,ATRA通过抑制Notch1促进神经干细胞的分化。     

大鼠创伤性颅脑损伤后脑室下区内源性神经干细胞的增殖与分化

目的探讨创伤性脑损伤后脑室下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）的增殖分化的时程变化。方法采用随机数字表法将大鼠 分为3组,对照组不做任何处理,假手术组仅切开头皮和颅骨开窗,实验组采用Feeney氏法造成颅脑损伤（TBI）。选用Nestin与 BrdU两种细胞标志物及神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质细胞标志物GFAP,采用免疫荧光化学方法对3 组脑组织标本分别行双标蛋白抗体免疫荧光染色,检测TBI 后SVZ 内源性NSCs 的增殖、分化变化。结果TBI 后,伤侧 SVZNestin/NSE 、Nestin/GFAP、BrdU/NSE、BrdU/GFAP标记阳性细胞均明显增多,伤后第1天开始升高,第3天达峰值,第14天 恢复正常,实验组4个时间点间及实验组与对照组对应时间点间的比较差异均有显著性意义,其中以Nestin/GFAP标记的增殖分 裂阳性细胞升高最显著。结论TBI后,动员了伤侧SVZ中的NSCs,诱导该区内源性NSCs的增殖分化,提示SVZ是NSCs增殖 分化的重要的生发中心之一。     

成年小鼠脑室下区神经干细胞培养与鉴定体系的建立

目的 建立系统的成年小鼠脑室下区神经干细胞分离、培养及鉴定体系.方法 用无血清方法分离培养成年小鼠脑室下区来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学方法检测Brdu、神经干细胞标记物nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuj1、GFAP、NG2.用Western boltting和RT-PCR方法进一步检测神经干细胞标记物nestin和SOX2的表达.结果 从成年小鼠脑室下区分离培养出具有自我更新、增殖的神经球,构成神经球的细胞nestin和SOX2呈阳性,它们分化后产生Tujl阳性的神经元、GFAP阳性的星型胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞.结论 建立了简单、稳定的培养成年小鼠脑室下区神经干细胞方法.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

青蒿琥酯通过PI3K-Akt通路促进大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的体外研究

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 不同浓度的ART(400 nmol/L、800 nmol/L、1.6 μmol/L、3.2 μmol/L)作用于NSCs 24 h后,采用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响.促增殖作用明显的800 nmol/L ART组加入10 μmol/L PI3K-Akt通路阻断剂(LY294002),采用CCK-8法检测该通路对NSCs增殖的影响;分别设置空白对照组、LY294002组、800 nmol/L ART组、800 nmol/L ART+ LY294002组,待细胞培养24h时,行Ki-67免疫荧光染色观察ART对NSCs增殖的影响及PI3K-Akt通路在其中的作用,同时采用Western blot检测各组Nestin、Akt及p-Akt蛋白的表达水平.结果 ①CCK-8法检测结果显示800 nmol/L ART组在波长450 nm处的光密度值较空白对照组明显升高,在加入LY294002后,其光密度值明显下降(P＜0.05),与空白对照组水平相当;②Ki-67免疫荧光染色结果提示800 nmol/L ART可促进NSCs增殖,LY294002可抑制这一作用;③Western blot检测结果显示:神经干细胞表面标志蛋白Nestin及p-Akt蛋白表达水平在800 nmol/L ART组明显上调,在加入LY294002后两者表达水平均下调(P＜0.05).结论 ART可在体外促进SVZ区NSCs的增殖,其机制与PI3K-Akt信号通路相关.     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

DLL1在骨形态形成蛋白9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的 探讨Notch配体Delta-like1(DLL1)在骨形态形成蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及机制.方法 利用DLL1重组腺病毒上调永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)中DLL1 mRNA的表达,分别采用细胞化学染色、活性测定对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积的影响;其次裸鼠皮下异位成骨实验进一步了解DLL1的体内成骨作用;最后用qRT-PCR、Western blot和荧光素酶检测DLL1对BMP9经典信号通路中Ⅰ型受体、Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)转录活性影响.结果 与对照组相比,DLL1在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs早期成骨指标ALP活性和晚期成骨指标钙盐沉积的生成;同时也能明显促进BMP9诱导的MSCs裸鼠皮下异位成骨作用;BMP9信号通路中ALK2表达明显增加,而对ALK1则没有影响;Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性明显增加(P＜0.05).结论 DLL1可以促进BMP9诱导的MSCs成骨分化,可能通过影响BMP9信号通路来实现其促成骨作用.     

帕金森病大鼠模型激发自体脑内神经干细胞增殖的实验研究

目的　研究帕金森病 (Parkinson’sdisease ,PD)大鼠激发自体脑内神经干细胞的增殖情况。方法　选用SD大鼠 ,将 6 羟多巴胺 (6 OHDA)注入纹状体内制作PD大鼠模型 ,假手术对照组注入等量生理盐水 ,于不同时间点处死大鼠。处死前均注射 5 溴脱氧尿苷 (Brdu)。免疫组织化学方法动态检测Brdu和巢蛋白 (Nestin)的表达 ,以确定脑内增殖细胞和神经前体细胞数量 ,Brdu/Nestin免疫双标确定脑内神经干细胞的增殖情况。结果　同正常组、假手术对照组比较 ,PD大鼠损伤侧海马区、侧脑室室管膜下区和黑质区的Brdu 细胞、Nestin 细胞和Brdu /Nestin 细胞数在模型成功后的第 3、5、7天明显增加 ,14d后逐渐减少 ,2 8d后恢复到正常水平。结论　 6 OHDA纹状体内注射制作PD的模型大鼠能够激活自体神经干细胞增殖。     

rhBMP2对人牙髓干细胞分化及Delta蛋白表达的影响

目的：研究重组人骨形成蛋白2（rhBMP₂）对人牙髓干细胞分化及Delta蛋白表达的影响,为人牙髓干细胞的研究提供理论依据。方法：酶消化法获得人牙髓干细胞,光镜下进行形态学观察,免疫荧光法检测细胞表面标志的表达;取第5代牙髓干细胞, 分为实验组（加含50 μg•L^-1rhBMP₂的培养液）及阴性对照组（只加入培养液）,检测碱性磷酸酶活性和Delta蛋白表达的变化。结果：人牙髓干细胞呈集落状生长, 免疫组织化学检测显示nestin、 vimentin染色呈阳性,免疫荧光法检测STRO-1呈阳性。与阴性对照组比较,实验组第7、14及21天碱性磷酸酶活性均明显升高（P<0.01）,第21天Western blotting法检测Delta蛋白表达明显升高(P<0.05)。 结论：培养的牙髓干细胞具有干细胞特性,并且rhBMP₂可使其碱性磷酸酶活性增高并上调Delta蛋白表达,提示Delta蛋白可能参与牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向神经细胞分化的潜能。方法体外培养人BMMSCs,并诱导其向神经细胞分化。诱导前后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞类型,流式细胞术检测细胞周期以确定细胞增殖活性。结果分离培养的BMMSCs有克隆增殖能力。诱导后,分化细胞呈现典型神经元的表型,且免疫荧光染色呈NSE阳性。流式细胞术分析显示诱导前BMMSCs的增殖指数(PI)较高,细胞增殖活跃。与诱导前比较,诱导分化细胞的PI显著降低(P<0.01),细胞增殖发生抑制,而分化阶段各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMMSCs可以在体外增殖扩增,并能分化为神经元样细胞,且分化的神经元样细胞能较长时间存活。