人肝癌裸鼠移植模型阿霉素诱导法建立肝癌多药耐药细胞系

目的:建立人肝癌多药耐药细胞系研究其耐药特性及机制.方法:给予移植人肝癌细胞的裸小鼠腹腔注射阿霉素(ADM)长期诱导,获得多药耐药细胞系BEL-7402/ADM.相差显微镜和HE染色观察细胞,MTT法检测耐药细胞的多药耐药性,流式细胞术检测耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达.结果:BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了20.33倍.BEL-7402/ADM细胞表面P-gp和MRP表达阳性,与对照细胞BEL-7402表达比较,差异十分显著(P<0.01).GSH/GST表达无明显变化.结论:BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,该模型的建立对研究肝癌多药耐药的产生及逆转具有重要价值.     

川芎嗪对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响

目的观察川芎嗪（TMP）对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM中P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）表达的影响,研究TMP对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM的逆转机制。方法将人肝癌细胞耐药株BEL-7402/ADM及其亲本细胞BEL-7402分为：亲本组、耐药组、逆转组（耐药＋TMP）、阳性对照组（耐药＋维拉帕米）、二抗阴性对照组,用免疫组化SABC法和流式细胞术对照观察TMP对BEL-7402/ADM中P-gp表达的影响。结果流式细胞术结果显示耐药组显著高于亲本组（P〈0.01）;耐药＋TMP组和耐药＋维拉帕米组均显著低于耐药组和亲本组（P〈0.01）。免疫组化SABC法显示耐药组P-gp阳性表达率显著高于亲本组（P〈0.01）;TMP组、维拉帕米组的P-gp阳性表达率显著低于耐药组（P〈0.01）。结论 TMP能显著降低人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM细胞表面P-gp的表达,增加阿霉素等化疗药物对BEL-7402/ADM的细胞毒性作用,从而增加对肿瘤细胞的抑制率,提高化疗疗效。     

白血病耐药细胞中多药耐药基因MDR1与核转录因子κB的关系

目的:研究核转录因子κB与多药耐药基因MDR1在白血病化疗耐药中的作用,阐明核转录因子κB(NF-κB)与白血病多药耐药的关系及相关分子机制。方法：白血病细胞K562和阿霉素(ADM)诱导的耐药细胞K562/ADM分别应用ADM（0、0.25、0.50、1.00和2.00 μg·L^-1）或丝裂霉素(MIT)（0、2、4、8和16 mg·L^-1）　作用48 h,通过MTT法检测细胞生存率,计算细胞耐药指数;RT-PCR方法检测MDR1和IκB mRNA表达;Western blotting方法检测P-gp和P65的蛋白表达。结果：ADM和MIT分别作用后,与空白对照组比较,白血病细胞K562细胞生存率下降(P<0.01),呈剂量依赖性;ADM和MIT对耐药细胞K562/ADM生存率作用不明显;在mRNA水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的MDR1 mRNA高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00　 μg·L^-1>或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562细胞和K562/ADM细胞,IκBα mRNA表达均下降(P<0.01),并呈剂量依赖性;在蛋白水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的P-gp蛋白高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00 μg·L^-1或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562/ADM细胞,P-gp蛋白表达量升高(P<0.01),同时P65蛋白表达量升高,且呈药物剂量依赖性(P<0.01)。结论：MDR1基因及P-gp蛋白的高表达很可能是白血病细胞K562多药耐药性形成的关键机制,而NF-κB的激活可能参与了多药耐药的调控。     

川芎嗪对转基因多药耐药细胞K562/MDR耐药性的逆转作用

目的：研究川芎嗪（TMP）与环孢菌素A（CsA）单独及联合逆转人红白血病多药耐药细胞K562/MDR的多药耐药性（MDR）,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法：分别以倍比稀释后不同浓度的TMP（50～6　400 mg?L^-1 ）和CsA（0.5～256 mg·L^-1 ）作用于体外培养的K562/MDR细胞72 h,采用MTT法检测细胞生长率,确定TMP和CsA的非细胞毒性剂量;采用非细胞毒性剂量,实验分为5组：G1组（TMP+ADM+K562/MDR）、G2组（CsA+ADM+K562/MDR）、G3组（TMP+CsA+ADM+K562/MDR）、阴性对照组（以K562/S代替K562/MDR）、空白对照组（以1640培养基代替药物）,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度,即IC₅₀,计算耐药倍数和逆转倍数;利用荧光分光光度法检测各组细胞内ADM浓度;流式细胞术检测跨膜糖蛋白P-gp的表达情况。结果：TMP及CsA的非细胞毒性剂量分别为320和2.0 mg·L^-1,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA均能降低K562/MDR细胞的耐药性,逆转倍数分别为5.2及9.6倍,并且两者联合应用,逆转倍数为15.6倍;TMP和CsA单独及联合应用均能明显增加K562/MDR细胞内ADM浓度;TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,并且两者联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显降低,与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01)。结论：TMP和CsA单独及联合应用可逆转K562/MDR细胞对化疗药物ADM的MDR,且两者具有协同作用。其逆转机制可能为降低P-gp水平,升高细胞内ADM浓度,增强对ADM的敏感性,从而发挥治疗肿瘤的作用。     

人肝癌多药耐药细胞中ERK5的表达

目的 检测人肝癌多药耐药细胞(hepG2/ADM和BEL-7402/5-FU)及亲本细胞(hepG和BEL-7402)中ERK5的表达,探讨其对肝癌细胞多药耐药的影响.方法 MTT法测定人肝癌多药耐药细胞株多种化疗药物的交叉耐药性,实时荧光定量PCR检测ERK5在人肝癌多药耐药细胞及亲本细胞中mRNA水平的表达,western-blotting检测ERK5蛋白水平的表达.结果 hepG2/ADM对ADM、5-FU 、CDDP的耐药指数分别为12.34、5.74、3.81;BEL-7402/ 5-FU对5-FU、VCR、OHP、MTX和ADM的耐药指数分别为15.32、10.08、5.85、6.74和3.26.与亲本细胞相比较,在hepG2/ADM细胞中ERK5 mRNA和蛋白表达均升高,而在BEL-7402/5-FU细胞中ERK5 mRNA表达降低,ERK5蛋白表达升高.结论 ERK5的表达与人肝癌多药耐药的发生密切相关,为逆转治疗肝癌细胞多药耐药研究提供了新思路.     

靶向抑制肝癌耐药细胞多药耐药基因表达的实验研究

目的：构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA（shorthairp in RNA,shRNA）表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。方法：利用分子克隆技术,将含MDR1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,RT-PCR分析MDR1mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞P-gp的表达。结果：PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制MDR1mRNA的表达;P-gp的表达阳性率降低了57.3%,P〈0.05。结论：构建的pshRNA-MDR1表达质粒能靶向抵制肝癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达。     

人膀胱癌耐药细胞系T24/ADM的建立及其耐药机制

目的建立人膀胱癌耐药细胞系,对其耐药机制进行初步探讨。方法采用阿霉素浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系T24/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,应用RT-PCR和Western blot比较两种细胞P-GP、MRP和LRP的表达差异来探讨可能的耐药机制。结果建立了T24/ADM耐药细胞系,对ADM、VCR和VP16有交叉耐药,P-GP、MRP和LRP在耐药细胞系中表达升高。结论 T24/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因表达升高是T24/ADM获得耐药的主要机制之一。     

多药耐药细胞系A549/ADM的建立及部分特性

目的建立多药耐药细胞系A549/ADM和初步探讨人肺腺癌细胞多药耐药的发生。方法对肺腺癌细胞A549采用持续低浓度和逐渐增加阿霉素浓度间歇诱导,建立多药耐药细胞系;使用流式细胞仪器分别检测敏感细胞系和耐药系的P-gp和MRP的表达;采用MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度。结果与母细胞系相比,耐药细胞系A549/ADM对ADM的耐药程度增加了14.29倍,对VCR、DDP、VP-16均有不同程度的耐药,对5-FU无耐药性;耐药细胞系A549/ADM表面P-GP、MRP表达分别为74.8%和61.2%(P<0.01)。结论A549/ADM对多种常用肿瘤化疗药物表现有不同程度的耐药,其耐药性可能与P-GR和MRP高表达有关。     

利福霉素逆转多药耐药细胞系A549/ADM的实验研究

目的:探讨利福霉素逆转人肺腺癌细胞多药耐药的发生及逆转机制.方法:采用流式细胞仪检测敏感细胞系、耐药细胞系的P糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达;MTT法检测其对多种化疗药物的耐药程度及利福霉素对其耐药的逆转效果;采用细胞内阿霉素含量的方法测定利福霉素对多药耐药的逆转作用.结果:多药耐药细胞系A549/ADM的P-gp、 MRP表达分别为74.8%和61.2%;加用利福霉素后,A549/ADM细胞内ADM的含量显著增加,A549/ADM对ADM敏感性增加了2.51倍,对VCR、DDP及VP-16敏感性分别增加7.38倍、1.29倍、2.86倍.结论:A549/ADM对多种常见肿瘤化疗药物表现不同程度耐药,其耐药性可能与P-gp、MRP高表达有关;利福霉素对A549/ADM的多药耐药有一定的逆转作用.     

MDR1/MRP反义寡核苷酸逆转胃癌细胞耐药的研究

目的:探讨MDR1/MRP反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodooxynucleotide,ASODN)片段逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药(Multidrugresistance,MDR)的作用.方法:经MDR1或多药耐药相关蛋白(Multidrugresistance-asscociated protein,MRP)ASODN分别或联合转染SGC7901/ADM细胞后,采用RT-PCR法检测MDR1mRNA和MRPmRNA的表达.免疫细胞化学检测SGC7901/ADM细胞内p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、MRP的表达,流式细胞术检测瘤细胞内Rh123的潴留状况,MTT法检测瘤细胞对阿霉素、卡铂等抗癌药的敏感性.结果:SGC7901/ADM细胞经ASODN转染12h后,MDR1和MRP mRNA的表达均降低,转染24h后下降最明显,48h后恢复至转染前水平.经转染ASODN48h后,SGC7901/ADM细胞P-gp、MRP的表达显著下降,瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于转染前,且联合转染MDR1和MRP ASODN后瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于单纯转染组.SGC7901/ADM细胞在联合转染MDR1和MRP ASODN后对阿霉素、卡铂等化疗药物的敏感性明显高于单纯转染ASODN.结论:分别转染MDR1或MRP ASODN可部分逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药,而联合转染2种ASODN则可显著提高瘤细胞耐药逆转效率.     

MDR、MRP与肝癌细胞多重耐药性关系的研究

目的 探讨肝癌细胞多重耐药性形成的分子机制。方法 采用逐步培养法，诱导人肝癌细胞株HepG2产生耐药性，以MTT法测定其耐药性的程度，检测细胞表面MDR、MRP分子表达水平，并确定其与耐药性的关系。结果 耐药细胞表面MDR、MRP的表达明显增高，药物在细胞内的积聚减少；阻断MDR、MRP的功能，可明显逆转细胞的耐药性。结论 MDR、MRP的高表达是肝癌细胞形成多重耐药的性要机制之一。     

HL-60/ADM细胞系耐药性检测

目的　检测 HL- 6 0 / ADM细胞化疗药物敏感性及 MRP表达。方法　以 HL- 6 0 / ADM细胞为实验对象 ,对化疗敏感的 HL - 6 0细胞为对照 ,MTT法检测药物敏感性 ,免疫细胞化学法检测 MRP蛋白的表达 ,PT- PCR法检测MRP m RNA表达。结果　两种细胞生长周期基本一致 ;HL - 6 0 / ADM细胞对 ADM、MTZ、VCR、H四种化疗药物 IC50 显著高于 HL- 6 0细胞 (P<0 .0 1) ,RF均在 2 0倍以上 ;HL- 6 0 / ADM表达 MRP m RNA,细胞膜表面 MRP阳性。结论　 HL-6 0 / ADM细胞系适合体外 MDR研究。     

人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株的建立及其生物学特性观察

目的:建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。方法:采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立5-FU获得性BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。MTT法检测耐药细胞株对多种化疗药物的交叉耐药性。观察其细胞形态学、生长曲线、倍增时间、平板克隆形成率、贴壁率、细胞周期分布、染色体核型以及裸鼠致瘤性。流式细胞术检测阿霉素在亲本及耐药细胞株内的积聚量。免疫细胞化学法检测胸苷酸合酶在耐药细胞内的表达。结果:成功建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株模型。该耐药细胞对阿霉素、长春新碱、奥沙利铂及甲氨蝶呤均有不同程度的交叉耐药性,但对羟基喜树碱仍较敏感。体外培养见细胞趋向群集性生长。耐药细胞株倍增时间较亲本细胞株长,克隆形成率则较亲本细胞株低,差异有统计学意义。耐药细胞贴壁率在23、h明显低于亲本细胞株,其G0/G1期细胞分布比率较低而S期比率明显增加。阿霉素在耐药细胞株内的积聚量低于亲本细胞株,耐药细胞株胸苷酸合酶的蛋白表达量较亲本细胞株明显增强。结论:人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株可以成为研究5-FU获得性耐药机制及开展多药耐药逆转剂筛选较好的体外模型。     

微波热疗对人乳腺癌阿霉素细胞MCF-7多药耐药蛋白及耐药性的影响

目的探讨微波热疗对人乳腺癌阿霉素细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM的多药耐药蛋白表达和耐药性的影响。方法应用Real-TimePCR法检测微波热疗对P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响和高效液相色谱法(HPLC)检测微波热疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果MCF-7/ADM细胞在微波热疗后4h和24h,P-gp、MRP表达量明显下降(P<0.01)。微波热疗以后肿瘤细胞内阿霉素(ADM)浓度有明显上升(P<0.01)。结论微波热疗抑制了耐药蛋白的表达,增加了细胞内的药物浓度,热疗可能是逆转化疗耐药从而提高化疗效果的一种有效手段。     

The Roles of Four Multi-drug Resistance Proteins in Hepatocellular Carcinoma Multidrug Resistance

The roles of multi-drug resistance protein 1 (MDR1), multi-drug resistance related pro- tein 1 (MRP1), lung resistance protein (LRP) and breast cancer resistance protein (BCRP) in the multi-drug resistance (MDR) of hepatocellular carcinoma (HCC) were studied. By exposing HepG2 cell line to progressively increased concentrations of adriamycin (ADM), HepG2 multi-drug resistant subline (HepG2/ADM) was induced. The MDR index of HepG2/ADM was detected by using MTT. The expressions of the four MDR proteins in the three cell lines (L02, HepG2, HepG2/ADM) were investigated at mRNA and protein levels by real-time RT-PCR and Western blot respectively. Our re- sults showed that when the ADM concentration was under 100 μg/L, HepG2 could easily be induced to be drug-resistant. The IC50 of the HepG2/ADM to ADM was 282 times that of HepG2. The expres- sion of MDR1 and BCRP mRNA in HepG2/ADM cells were 400 and 9 times that of HepG2 cells re- spectively while there was no difference in the mRNA expressions of MRP1 and LRP. There was no difference between HepG2 and L02 cells in the mRNA expressions of the four genes. At the protein level, the expressions of MDR1, BCRP and LRP but MRP1 in HepG2/ADM were significantly higher than those of HepG2 and L02. Between HepG2 and L02, there was no difference in the ex- pressions of four genes at the protein level. HepG2/ADM is a good model for the study of MDR. The four genes are probably the normally expressed gene in liver. The expressions of MDR1 and BCRP could be up-regulated by anti-cancer agents in vitro. The MDR of HCC was mainly due to the up-regulation of MDR1 and BCRP but MRP1 and LRP. These findings suggest they may serve as targets for the reversal of MDR of HCC.     

实时荧光定量PCR检测肝癌细胞多药耐药相关蛋白MRP2、MRP3及MRP5 mRNA的表达

目的 研究多药耐药相关蛋白2(MRP2)基因及MRP3、MRP5基因在正常肝脏细胞系L-02、肝癌细胞系BEL及肝癌耐药细胞系BEL/ADM的表达差异,并探讨其在肝癌耐药中的意义.方法 分别提取L-02、BEL及BEL/ADM细胞的总RNA,利用实时荧光定量PCR法检测MRP2、MRP3、MRP5基因的表达水平.结果 MRP2基因在BEL/ADM细胞中的表达量明显高于在L-02、BEL细胞中的表达(P=0.000),而其在L-02、BEL两种细胞中的表达没有显著性差异(P=0.468);MRP3、MRP5基因表达量在L-02、BEL、BEL/ADM三种细胞中均有显著性差异(P=0.000).结论 MRP2可能参与了肝癌的内在性耐药,而MRP3、MRP5可能与肝癌的获得性耐药有关.