白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体,并对其进行鉴定。方法提取白假丝酵母菌基因组DNA为模板,经聚合酶链反应（PCR）获取SAP2目的基因;双酶切SAP2基因与原核表达载体pMAL c2x（+）,构建pMAL c2x/SAP2重组质粒;在大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达出可溶性的融合蛋白;用可溶性Sap2免疫小鼠制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清效价,亲和层析法纯化抗血清后,利用Western免疫印迹(Western Blot)检测抗体特异性。结果该研究成功制备了抗Sap2多克隆抗体,抗体效价＞1∶51 200;Western Blot检测结果表明,该抗体可特异性识别Sap2蛋白。结论纯化后的Sap2作为抗原免疫小鼠,有较好的抗原性和免疫原性,可成功制备多克隆抗体,并具有高特异性,为快速检测侵袭性白假丝酵母菌感染奠定了基础。     

靶向白色假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的小分子干扰RNA对白色假丝酵母菌毒力影响

目的探讨靶向白色假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)的小分子干扰RNA(siRNA)对白色假丝酵母菌SAP的基因表达影响,以期为RNA干扰技术抑制真菌毒力提供实验基础。方法设计并合成SAP靶向的siRNA,用醋酸锂转染白色假丝酵母菌,试验设空白对照组、错义对照组、SAP siRNA组,采用RT-PCR测定转染后白色假丝酵母菌SAP mRNA表达水平,制备BSA培养基测定天冬氨酸蛋白酶活性及小鼠毒力实验。结果与空白对照组、错义对照组相比,转染48h后,siRNA组白色假丝酵母菌中SAP mRNA表达明显下调为(0.51±0.05),siRNA组天冬氨酸蛋白酶活性PA值为(0.84±0.04)均高于空白及错义对照组,小鼠30d死亡率显著降低为20.0%。结论化学合成的靶向SAP siRNA能够下调白色假丝酵母菌中SAP基因的表达,降低白色假丝酵母菌的毒力,该实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗真菌治疗奠定基础。     

阴道分泌物中白假丝酵母菌蛋白酶的致病性和耐药性研究

目的:检测阴道分泌物(白带)中白假丝酵母菌对人体的致病性,探讨其对抗真菌药物的敏感性。方法:采用沙堡葡萄糖琼脂平板法对阴道分泌物标本中分离的218株白假丝酵母菌进行蛋白酶活力测定。然后用Rosco纸片扩散法检测218株白假丝酵母菌对伊曲康唑、氟胞嘧啶、二性霉素B、酮康唑、氟康唑、制霉菌素、益康唑、咪康唑等抗真菌药物的敏感性。结果:218株白假丝酵母菌全部检出蛋白酶,其中蛋白酶活力高的为177株,占81.20%;活力中等的为32株,占14.68%;活力低的为9株,占4.13%。患者组蛋白酶阳性菌株的检出率及其蛋白酶的活力均显著高于携带者组(P<0.01)。白假丝酵母菌对制霉菌素、二性霉素B和氟胞嘧啶的敏感率均较高,分别为95.00%、89.00%和84.50%;其次为酮康唑和伊曲康唑,其敏感率分别为30.70%和11.90%;益康唑、咪康唑和氟康唑的敏感率较低,分别为7.30%、5.00%和1.80%。结论:蛋白酶是白假丝酵母菌的重要毒力因子,蛋白酶活力可直接反映人体感染毒力强弱和致病程度的客观指标。白假丝酵母菌对抗真菌药物易产生耐药性。因此开展对白假丝酵母菌的鉴定及药物敏感性检测,为指导临床抗感染治疗和合理选择药物,有效控制和减少真菌感染而奠定理论基础。     

白假丝酵母菌基因分型方法的研究进展

正随着医疗技术的快速发展,各种医用材料和侵入性操作技术在临床广泛应用,广谱抗菌药物、糖皮质激素和免疫抑制剂在临床的大量使用,医院内真菌感染的比例越来越高,其中白假丝酵母菌在真菌感染中所占比例最高,是临床中常见的致病菌之一。白假丝酵母菌主要引起皮肤、黏膜的浅表部位感染,侵袭性呼吸系统感染和血流感染等,其中血流感染相对严重,如白假丝酵母菌血症。早在二十世纪八十年代,Pfaller等~([1])报道,侵袭性假丝酵母菌感染     

白假丝酵母菌刺激体外培养人阴道上皮细胞表达TLR2的效果

目的:探讨体外培养人阴道上皮细胞表达的Toll样受体2(TLR2)是否受白假丝酵母菌孢子的调节.方法:采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测热灭活白假丝酵母菌孢子处理12h和24 h的体外培养的人阴道上皮细胞TLR2 mRNA的表达水平.结果:阴道上皮细胞表达的TLR2 mRNA水平在热灭活白假丝酵母菌孢子作用12 h和24 h时均明显高于无刺激的对照组(P＜0.05).结论:体外培养人阴道上皮细胞表达的TLR2 mRNA在白假丝酵母菌孢子作用12h和24h增加,人阴道上皮细胞在识别和启动防御白假丝酵母菌感染中TLR2可能起重要作用.     

白假丝酵母菌生物膜与其耐药性的相关性研究

[目的]观察白假丝酵母菌生物膜形成过程中耐药性产生变化情况.[方法]利用载玻片法形成白假丝酵母菌生物膜结构,倒置显微镜观察不同阶段的生物膜形态,用NCCLS微量稀释法检测浮游状态白假丝酵母菌耐药性,用XTT减低法获得生物膜耐药性的变化情况.[结果]白假丝酵母菌耐药性随着生物膜的成熟不断增强,比游离态菌 高100倍以上.[结论]成熟生物膜与耐药性增强有明显正相关性.     

白假丝酵母菌致食物中毒机理的研究

目的研究白假丝酵母菌致食物中毒的机理。方法首先提取白假丝酵母菌的毒性物质,明确其性质,再进行小白鼠灌胃试验和家兔灌胃试验。结果白假丝酵母菌毒素为热不稳定外毒素,能使小白鼠疲倦、厌食、竖毛、发绀、颤抖、呼吸加快、腹泻、脱水甚至死亡;能使家兔心跳、呼吸加快、呕吐、腹泻。结论白假丝酵母菌能产生热不稳定外毒素,引发食物中毒。     

白假丝酵母菌对唑类药物耐药机制的研究进展

近年来，白假丝酵母菌对唑类药物耐药问题备受人们关注。随着耐药菌株的不断出现，耐药机制的研究也取得了一定的进展。白假丝酵母菌对唑类药物耐药机制主要与Ergll基因、CDR1和CDR2基因、MDR1基因的过度表达及突变有关。本文就这方面研究新进展进行综述。     

雌激素诱导白假丝酵母菌阴道炎小鼠模型中环氧化酶-2的表达

目的:探讨雌激素对白假丝酵母菌性阴道炎模型小鼠阴道组织中环氧化酶-2(COX-2)表达的影响及其在发病机制中的意义。方法:80只小鼠随机分为雌激素化未感染白假丝酵母菌组(E组)、未雌激素化感染白假丝酵母菌组(I组)、雌激素化感染白假丝酵母菌组(EI组)和空白对照组(C组)。制作白念珠菌性阴道炎小鼠模型,每组分别于接种后第2天、第4天、第7天和第14天取小鼠阴道组织,用免疫组化方法检测组织中COX-2的表达。结果:除C组外,各组小鼠阴道组织内第2天出现COX-2的阳性表达,持续升高至第7天达到高峰,第14天时开始下降;E组在第4、第7天COX-2免疫组化检测OD值分别为0.157±0.017和0.161±0.014,与相应C组(0.101±0.014和0.106±0.014)比较均具有显著性统计学差异(P均<0.05)。EI和I组第7天的OD值分别达到0.275±0.059和0.234±0.063,与对照组相比明显上调(P均<0.01),且EI组显著高于I组(P<0.05)。结论:在白假丝酵母菌性阴道炎小鼠模型中,雌激素能通过诱导阴道组织中COX-2的表达在其发病机制中起重要作用。     

白假丝酵母菌感染分布及耐药性分析

回顾性分析某院2003-2005年各类临床标本分离的186株白假丝酵母菌分布特点及药敏结果。186株白假丝酵母菌主要分离自呼吸道标本，占60．75％；其次为中段尿18．28％，分泌物11．83％，血液4．30％，其他4．84％。白假丝酵母菌对两性霉素B、制霉菌素、5-氟胞嘧啶、氟康唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、伊曲康唑的耐药率分别为4．84%、9．68%、41．94％、63．98％、61．83％、67．23％、46．77％、66．67％；3年来，白假丝酵母菌除对两性霉素B和制霉菌素的耐药率显著降低（P〈O．01），对益康唑的耐药率没有太大变化（P〉0．05）外，对5-氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑、咪康唑的耐药率显著增高（P〈0．01或P〈0．05）。     

白假丝酵母菌耐药性及多药耐药基因CDR1和CDR2的表达

目的:探讨女性下生殖道白假丝酵母菌耐药性及多药耐药基因CDR1和CDR2的表达。方法:培养、分离女性下生殖道假丝酵母菌感染耐药菌株,进行菌种鉴定、药敏试验和耐药性分析,应用RT-PCR检测多药耐药基因CDR1和CDR2的表达。结果:272例培养阳性的菌株中白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌分别占79.8%、9.56%、8.10%和2.57%。217例白假丝酵母菌耐药菌株中特比耐芬耐药率最高,达94.93%,伊曲康唑和咪康唑的耐药率分别为15.21%和5.99%。RT-PCR显示白假丝酵母菌株耐药组CDR1和CDR2高表达。结论:女性下生殖道假丝酵母菌感染仍以白假丝酵母菌为主,非白假丝酵母菌感染呈上升趋势,白假丝酵母菌对常用抗真菌药物的耐药性呈上升趋势。白假丝酵母菌多药耐药基因CDR1和CDR2高表达,与临床白假丝酵母菌耐药密切相关。     

人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统序列分析

目的 对人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建及序列分析。方法 采用RT-PCR方法将肺组织中提取总RNA扩增人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列，将其插入到真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建重组表达质粒，并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果 入谷胱甘肽硫转移酶M1克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，测序结果同Genbank GSTM1(GI：183668)cDNA序列相比较，在619位点C→A，氨基酸由Pro→Thr；在519位点C→G，编码的氨基酸仍为1ys；在528位点C→T，编码的氨基波仍为Asp。同源性为99％，基因登陆号为AY532926。结论 入谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建，为进一步进行真核细胞和动物的解毒机制研究，提供应用材料。     

白色念珠菌upc2基因G1927A多态性与唑类药物耐药的关系

目的 探讨白色念珠菌upc2基因C末端单核苷酸多态性以及其对唑类药物耐药的影响。方法 对34株白色念珠菌临床株,纸片法测定5种药物敏感性,DNA测序法检测upc2基因单核苷酸多态性,RT-PCR法测定cdr1基因mRNA转录水平。比较耐药株和敏感株upc2单核苷酸多态性以及cdr1基因mRNA水平的差异。结果 14株白色念珠菌氟康唑耐药株（3株多重耐药,6株双重耐药,5株单一耐药）,20株敏感株对5种药物均敏感。5株耐药白色念珠菌upc2基因存在G1927A型多态性,20株敏感株upc2基因均为G1927野生型,G1927A型upc2基因检出率35.7%,显著高于敏感株（χ2 = 8.37,P ＜0.01）。G1927A型多重耐药株的cdr1基因mRNA水平高于G1927A型双重耐药株,并且二者均高于敏感株。结论 upc2基因G1927A单核苷酸多态性通过上调cdr1基因mRNA转录而引起白色念珠菌对唑类药物产生多重耐药或双重耐药表型。     

HSV 2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV 2） 多功能蛋白感染细胞多肽27（ICP27）真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞（Vero）中的表达。方法提取病毒株HSV 2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0 ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero 细胞,经RT PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果pCDNA3.0 ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT PCR 和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV 2 多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并能在Vero 细胞中表达。     

刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

目的 构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法 扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK 293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和western blot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果 PCR扩增获得约495 bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK 293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19 kDa。结论 成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T正确表达。     

白色念珠菌CDR基因表达与氟康唑体外药敏试验的关系研究

目的调查白色念珠菌临床株对氟康唑的耐药情况,研究白色念珠菌临床耐药基因的表达与氟康唑耐药之间的关系。方法采用M27-A2微量肉汤稀释法,对某院微生物实验室2010年分离保存的221株来自就诊患者的痰、中断尿、粪便和咽拭子的白色念珠菌进行氟康唑MIC值测定。以白色念珠菌18S RNA为内参照,采用RT-PCR技术观察比较耐药株和敏感株组在不同氟康唑浓度下CDR1和CDR2基因的转录水平。结果 221株白色念珠菌中,有57.47%（127株）对氟康唑敏感,10.86%（24株）剂量依赖敏感,31.67%（70株）耐药。不同药物浓度作用下,耐药株组CDR1和CDR2的表达量相对要高于敏感株组（P〈0.05）。结论白色念珠球菌对氟康唑耐药率较高,耐药株组CDR1和CDR2表达量高于敏感株组。