小鼠Ehrlich实体瘤局部DNA直接转染TGF-β1基因的研究

研究Ｅｈｒｌｉｃｈ 实体瘤局部ＤＮＡ 直接转染ＴＧＦ－β１ 基因的治疗效果。将真核表达载体ｐＳＶＴＧＦ－ β１ 直接瘤周转染Ｅｈｒｌｉｃｈ 实体瘤, 用原位杂交方法检测靶基因的表达, ＭＴＴ法检测脾脏细胞免疫功能, 并观察小鼠生存期及肿瘤生长速度。治疗组肿瘤细胞及瘤周组织有靶基因ｍ ＲＮＡ表达, 脾脏细胞免疫功能高于对照组, 肿瘤生长受到抑制, 治疗组小鼠生存期较对照组明显延长。ＴＧＦ－β１ 基因ＤＮＡ直接转染法可以明显抑制肿瘤生长,不影响全身细胞免疫功能,具有较大的潜在临床应用价值。     

TGF-β1质粒DNA前房注射在角膜内皮细胞表达的实验研究

目的 探索转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF—β1)真核表达质粒pMAM TGF—β1前房注射后在角膜内皮细胞的表达及其对局部抗角膜移植排斥反应基因治疗的可能性。方法 利用脂质体介导方法，将其直接注射至家兔前房内，2d后分别行角膜组织石蜡切片和角膜内皮撕片，通过SABC免疫组化方法检测角膜内皮细胞质粒DNA表达产物。TGF—β1的表达情况。结果 石蜡切片和内皮撕片均可见角膜内皮细胞内质粒DNA表达产物TGF—β1的表达为阳性。结论 通过前房注射法，外源基因可以转染至角膜内皮，并在角膜内皮细胞得到有效表达，为进一步研究。TGF—β1参与角膜局部免疫耐受的诱导和维持奠定了基础。     

Smad7基因转染拮抗TGF-β1对培养肾小管细胞的影响

目的 探讨Smad7基因转染对TGF-β1诱导的小管细胞生长阻滞，细胞凋亡和FN分泌的影响。方法 采用Tfx-50脂质体将小鼠Smad7转染入原代培养的。肾小管细胞，用MTT法观测小管细胞的增殖、流式细胞仪观测其细胞周期的变化；ELISA法测定小管细胞FN的分泌。结果 培养基添加TGF-β1(10ng/ml)48h后，小管细胞增殖能力明显下降，停滞于G1期的细胞数增多，细胞分泌的FN量也明显增高，相反，Smad7基因转染后可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的上述作用。结论 Smad7基因转染可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的影响，此结果为今后体内Smad7基因治疗研究奠定了基础。     

β1整合素-绿色荧光蛋白融合基因在角膜上皮细胞的功能性表达

目的:将β1整合素-绿色荧光蛋白(GFP)融合基因转染兔角膜上皮细胞并检测其对各细胞外基质蛋白的黏附能力。方法:构建β1整合素-GFP融合基因真核细胞重组表达质粒,并将其转染至兔角膜上皮细胞。利用RT-PCR、Western印迹和荧光显微镜观察融合基因表达,同时检测转染细胞的增殖情况及对各细胞外基质蛋白的黏附能力。结果:成功将β1整合素-GFP融合基因转染兔角膜上皮细胞并使其过表达;转染β1整合素对角膜上皮细胞增殖无明显影响,但使细胞对各细胞外基质蛋白的黏附能力明显增高。结论:建立了功能性β1整合素-GFP过表达的角膜上皮细胞模型,为研究β1整合素基因在角膜上皮细胞的功能及角膜细胞移植奠定基础。     

TGF-β_1诱导肺泡上皮细胞间质转化

目的:通过观察TGF-β1诱导下A549细胞出现的细胞形态学和E-cad表达的变化,探讨上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺纤维化发病机制中的作用。方法:体外培养A549细胞,以TGF-β1进行干预,收集不同时段的细胞,应用荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测TGF-β1干预前后E-cad的mRNA表达变化;倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;间接免疫荧光观察E-cad蛋白表达的变化。结果:倒置相差显微镜观察到TGF-β1干预后A549细胞由鹅卵石状变为梭形,形态如同肌纤维母细胞。间接免疫荧光显示A549细胞的E-cad表达(红色荧光染色)随时间延长逐渐减少。RT-PCR显示E-cad的mRNA表达下调(P<0.05)。结论:TGF-β1在体外诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化,肺泡上皮细胞间质转化是肺纤维化的重要发病机制之一。     

TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变

目的 检测转化生长因子（TGF-β1）能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞-间质细胞转变（epithelial-mesenchymal transition,EMT）及其相应的信号转导机制.方法 在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型细胞（RLE-6TN）中加入TGF-β1后,于不同时间段收取细胞,分别采用Real-time PCR及Western blot检测上皮及间质细胞标志物表达的改变;Western blot检测TGF-β1对RLE-6TN细胞p-Smad 2/3表达的影响;TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞形态学的改变采用倒置相差显微镜观察,超微结构的改变采用透射电子显微镜观察.结果 加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后,其间质细胞标志物表达上调,上皮细胞标志物的表达下调;加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后,其p-Smad 2/3的表达明显上调;形态学上,TGF-β1诱导RLE-6TN细胞向成肌纤维细胞样细胞转变;超微结构上,TGF-β1诱导RLE-6TN细胞特有的嗜锇性板层小体发生变性、肿胀并随TGF-β1作用时间延长最终完全消失.结论 TGF-β1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变,其机制部分与Smad信号转导途径相关.     

大鼠角膜中TGF-β1的表达及其意义

目的 :检测大鼠角膜中TGF - β1的含量及其表达部位。方法 :取大鼠的眼球切片 ,应用免疫组化方法检测TGF - β1在角膜中的含量和位置分布。结果 :在大鼠角膜的上皮层及基底细胞膜中存在TGF - β1。结论 :TGF - β1是一种多功能的细胞因子 ,它在角膜中的作用有待深入研究     

Lenti-eGFP体外转染兔角膜上皮细胞的实验研究

目的:观察慢病毒载体(Lentivirus vectors,LVs)介导的增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,eGFP)基因转染离体兔角膜上皮细胞对其生理功能的影响.方法:角膜上皮细胞的原代及传代培养并细胞鉴定.分正常细胞组(对照组)与转染细胞组.LVs介导的eG...     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

目的 将大鼠转化生长因子β1(TGF—β1)基因转染成骨细胞后，研究转基因细胞表达TGF—β1的情况。方法 通过Lipofectamine介导将TGF—β1基因导人大鼠成骨细胞，转染24h后通过SABC法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用SABC法检测转染细胞稳定表达TGF—β1的情况。结果 转染24h后，成骨细胞就有明显的TGF—β1蛋白和mRNA高表达。G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的TGF—β1表达。结论 TGF—β1基因转染成骨细胞后可获得稳定的高表达，采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

重组人转化生长因子-β1荧光质粒的构建及转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人转化生长因子（TGF）-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法：体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果：成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h：（8.22±2.02）%,24 h：（16.54 4±2.91）%,2 d：（14.06±3.67）%,4 d：（14.24±2.62）%,6 d：（12.36±2.28）%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205（P〈0.05）.结论：构建的TGF-β1荧光质粒可以转染软骨细胞并获得表达,为基因治疗骨性关节炎的研究提供基础.     

柚皮素对支气管上皮细胞中Smad介导的TGF-β1通路的影响

目的:观察柚皮素对支气管上皮细胞中Smad介导的转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)通路的影响,并研究其可能的机制?方法:培养HBE细胞,分为对照组?TGF-β1组和柚皮素干预组?柚皮素干预组分别与25?50 和100 μmol/L的柚皮素共孵育2 h后,与TGF-β1组一起加入TGF-β1?2 h后用real-time PCR方法检测各组细胞纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1) mRNA表达?另外在加入TGF-β1后30 min时,提取对照组?TGF-β1组和柚皮素高剂量组细胞总蛋白,用Western blot方法检测Smad2水平及磷酸化的Smad2水平,同时用免疫荧光法检测Smad2的核转位?结果:TGF-β1组的PAI-1 mRNA水平较对照组明显增高,随着给予柚皮素剂量的增大,PAI-1 mRNA水平明显降低?TGF-β1组经TGF-β1刺激30 min后,磷酸化的Smad2明显增加,经柚皮素干预后则随着柚皮素剂量的增加,Smad2磷酸化明显受抑制?各组的总Smad2水平无明显变化?免疫荧光实验显示TGF-β1组的细胞核内Smad2明显增多,而柚皮素干预组(100μmol/L)的细胞核内Smad2含量明显减少?结论:柚皮素可能通过抑制Smad2磷酸化及减少核内Smad2含量来影响TGF-β1在支气管上皮细胞中的生物功能?     

脂质体介导TFPI-2质粒DNA转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的探讨角膜基质细胞组织因子途径抑制物2(TFPI-2)的表达情况,为角膜新生血管的基因治疗提供方法.方法体外兔角膜基质细胞原代、传代培养;脂质体介导人类TFPI-2真核表达载体pBos-Cite-neo/TFPI-2转染角膜基质细胞,RT-PCR,Western blot技术检测转染前后基质细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白质的表达水平.结果转染前后基质细胞TFPI-2 mRNA的表达水平IATFPI-2/IAβ-actin分别为0.56±0.04、0.78±0.03;蛋白质的表达水平IA值分别为18.4±1.3、24.2±0.5,差异均有显著意义.结论培养角膜基质细胞可基础表达一定量的TFPI-2,转染TFPI-2质粒后使基质细胞TFPI-2 mRNA和蛋白质的表达增高,为开展角膜新生血管的基因治疗提供实验依据.     

脂质体介导TGF-β1 shRNA转染的方法

目的 探讨脂质体介导的转化生长因子β1(TCF-β1)短发夹RNA(shRNA)在人肿瘤细胞株的转入效率,为研究TGF-β1信号转导在肿瘤微环境中的作用机制提供方法依据.方法 化学合成TGF-β1小干扰RNA(siRNA),与脂质体转染介质混合制备转染复合物(Lip-shRNA),处理细胞24h后用流式细胞术(FCM)及人工计数法测定RD细胞的转入率;免疫荧光技术检测细胞TGF-β1蛋白表达水平.结果 荧光显微镜观察硫代磷酸化修饰的寡核苷酸转入4h后,shRNA主要定位在细胞浆,8h后细胞核中有较多的shRNA;FCM测得转入细胞转入率与Lip-shRNA复合物呈剂量依赖关系,人工测得shRNA的转入率与转入复合物在低剂量呈剂量依赖关系,但在高剂量时增高不明显.转人6d后各组细胞TGF-β1蛋白表达量较转入3d时明显减少,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 脂质体介导的TGF-β1shRNA在常见肿瘤细胞株中的转入效率与寡核苷酸的稳定性、Lip-shRNA复合物剂量、转入时间密切相关,该转染技术可以作为RNA干扰手段研究TGF-β1信号转导的病理学机制.     

TGF-β3拮抗TGF-β1诱导的FMT 改善小鼠肺纤维化

目的 研究转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β3是否能够抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞(human lung fibroblast, HLF)间质转化。方法 在体外培养原代HLF进行细胞实验,分为3组:对照组:给予等体积超纯水;TGF-β1组:细胞给予TGF-β1(4ng/ml)处理HLF 24h;TGF-β3组:细胞给予20ng/ml的TGF-β3预处理24h后加入TGF-β1(4ng/ml)处理24h。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和纤连蛋白(Fibronectin)蛋白的表达水平。在体内构建小鼠肺纤维化模型,分为3组:对照组:给予等体积0.9%氯化钠溶液气管滴注;模型组:博来霉素溶于0.9%氯化钠溶液,按2.0U/kg的浓度给予小鼠气管内滴注;TGF-β3干预组:于造模前1天,将TGF-β3(100μg/kg)给予小鼠尾静脉注射。HE和Masson染色法观察肺组织病理学变化,免疫荧光法检测α-SMA和Fibronectin蛋白的变化。结果 在体外,与TGF-β1组比较,TGF-β3组细胞迁移和侵袭能力降低,α-SMA和Fibronectin蛋白表达下调。在体内,与模型组比较,TGF-β3组小鼠肺组织病理变化改善,胶原沉积减少,α-SMA和Fibronectin蛋白荧光强度降低。结论 TGF-β3抑制TGF-β1引起的HLF间质转化,并改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。     

TGF-β_1抗体对体外培养翼状胬肉上皮细胞增殖抑制作用实验研究

目的:探讨不同浓度TGF-β1抗体对翼状胬肉上皮细胞增殖的抑制作用。方法:通过组织块培养法进行人翼状胬肉上皮细胞的体外培养,以不同浓度TGF-β1抗体(0、6.25、12.5、25.0、50.0、100μg/ml)作用于传代培养的翼状胬肉上皮细胞,MTT法检测不同时期(24h、48h、72h)细胞增殖抑制情况;免疫组织化学SABC法染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果:组织块培养法成功进行人翼状胬肉上皮细胞的原代和传代培养,并经角蛋白染色鉴定为上皮细胞;不同浓度TGF-β1抗体可明显抑制翼状胬肉上皮细胞的生长,且随浓度增加、时间延长,抑制率明显增高,PCNA的表达不同程度下降,各组间比较有统计学意义。结论:不同浓度TGF-β1抗体可明显抑制翼状胬肉上皮细胞生长,可作为治疗翼状胬肉的新型药物的研究方向。     

转化生长因子β1与大鼠心肌细胞肥大关系的实验研究

目的 探讨转化生长因子β1(TGF—β1)与大鼠心肌细胞肥大的关系。方法 培养新生大鼠心肌细胞，检测[^3H]—亮氨酸掺入量和心房利钠因子(ANF)的表达判断心肌细胞肥大，同时检测肥大心肌细胞TGF—β1表达。结果 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和TGF—β1均能增加心肌细胞[^3H]—亮氨酸掺入和ANF表达，两者合用效果更显著；AngⅡ还促进心肌细胞自分泌TGF—β1。结论 AngⅡ诱导心肌细胞分泌TGF—β1，AngⅡ和TGF—β1在诱导心肌细胞肥大中有协同作用。     

TGF-β_2和TGF-βRⅡ在大鼠角膜碱烧伤中表达及意义

目的:探讨大鼠角膜碱烧伤后不同时期转化生长因子β2(TGF-β2)及其Ⅱ型受体(TGF-βRⅡ)的表达及意义。方法:选择60只SD大鼠,随机分为两组,其中A组为对照组,B组为实验组,以右眼为实验眼,建立大鼠角膜碱烧伤模型。每日裂隙灯下观察角膜形态学的变化。分别于术后第1天、4天、7天、14天、21天、28天处死动物,行HE染色观察炎细胞的浸润情况,Masson三色染色法观察角膜基质层胶原纤维的排列和增殖情况。应用SABC法检测各组角膜组织中PCNA阳性成纤维细胞的增殖情况,TGF-β2和TGF-βRⅡ的含量变化情况。结果:碱烧伤后第1、4天PCNA阳性成纤维细胞数低于正常;第7、14天,PCNA阳性成纤维细胞增加;此后呈现下降趋势,但仍高于正常。碱烧伤后第4、7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的表达明显增加,此后逐渐下降,第28天时基本接近正常水平。结论:碱烧伤早期角膜瘢痕修复即已开始。碱烧伤后第4、7天TGF-β2和TGF-βRⅡ的分泌增加,两者同步表达,变化趋势一致。角膜瘢痕修复的病理过程与TGF-β2和TGF-βRⅡ分泌密切相关。     

TGF-β1诱导人肝HL7702细胞发生上皮细胞间质转化的实验研究

目的:探讨体外培养的人肝细胞系在重组人转化生长因子β1(TGF-β1)诱导下是否发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchyme transition,EMT)以及相关标志物的表达变化。方法:人类肝细胞HL7702在含20%小牛血清的1640培养液培养2 d,改用无血清培养并TGF-β1分别诱导24 h,48 h,72 h;观察诱导前后细胞的形态学变化,实时荧光定量RT-PCR及蛋白质免疫印迹技术分析细胞中EMT相关基因和蛋白表达情况。结果:显微镜下观察到TGF-β1诱导前,肝细胞是不规则的六边形,诱导后细胞形态拉长变成纺锤形,细胞间隙变大;实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹显示上皮化标志物E-钙黏附蛋白在TGF-β1诱导后的细胞中表达显著下降,而间质化标志物N-钙黏附蛋白、波形蛋白和Twist却显著增加。结论:正常人类肝细胞株HL7702经重组人TGF-β1的诱导发生上皮-间质转化,这为深入研究TGF-β1和肝纤维化之间的关系奠定了基础。     

Smad7对转化生长因子β1诱导的肺泡上皮细胞向间质细胞转变的影响

目的检测转化生长因子（TGF）β1能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变（EMT）,以及Smad7基因转染能否阻止此种转变及相关信号转导机制。方法采用脂质体法转染Smad7基因到大鼠肺泡Ⅱ型上皮（RLE-6TN）;实时荧光PCR及免疫印迹法检测转染前后上皮细胞标志物（E—cadherin,CK19）、间质细胞标志物（FN、Vimentin及α—SMA）及Smad信号通路相关蛋白表达变化;相差显微镜观察TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞形态改变,其超微结构改变采用透射电镜观察。结果成功转染Smad7到RLE-6TN;转染前,在TGFβ1作用下,RLE-6TN间质标志物的表达在mRNA和蛋白水平上调,而上皮标志物表达下调;转染后,其间质标志物下调的同时上皮标志物上调;转染前RLE-6TN在TGFβ1作用下p-Smad2／3表达上调,转染后其表达无明显改变;形态学上,TGFβ1能诱导肺泡上皮发生EMT,Smad7转染则能阻止EMT;超微结构上,TGFβ1能诱导肺泡上皮特有板层小体变性、肿胀并随其时间延长最终完全消失。结论TGFβ1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮向间质细胞转变,其机制部分与Smad信号转导途径相关,Smad7转染能在一定程度上阻止该转变。