p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法采用脂质转染的方法．将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１,观察ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒ＰＣＤＮＡ３为对照。免疫组化、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｐ１６基因表达,对转染后细胞生长情况、细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ,ＣＤＤＰ）敏感性的变化进行分析。结果外源ｐ１６基因的高水平表达显著掏了胶质瘤Ｕ２５１细胞的生长,克隆形成率减少,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了Ｇ１期阻滞,同时,细胞对顺铂的敏感性降低,化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,同时降低Ｕ２５１细胞对顺铂的化疗敏感性。ｐ１６基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的 探索Ｐ１６基因在脑胶质瘤生发展过程中的作用及其与脑胶细胞顺铂化疗敏感性关系。方法 采用脂质体转染的方法，将外源墅生型Ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２６１，观察Ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤的作用，并筛选阳性克隆。同时以空本质粒ＰＣＤＮＡ３为对照，免疫组化Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测Ｐ１６基因表达，对后细胞生长情况，细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｏｒｏｐｌａｔｉｕｍ，ＣＤＤＰ     

脑胶质瘤p16基因转染对细胞生长及放射敏感性的影响

目的　探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法　将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6,筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化检测p16基因表达,用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果　转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达,克隆形成率减少,生长速度明显减慢,对辐射的敏感性增强。结论　导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。     

人肝癌细胞肿瘤抑制基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的为了解肿瘤抑制基因ｐ５３和Ｒｂ基因与肝癌对药物敏感性之间的关系，本实验用逆转录病毒介导将野生型ｐ５３或Ｒｂ基因导入人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１并观察其药物敏感性的改变。方法将野生型ｐ５３ｃＤＮＡ或ＲｂｃＤＮＡ克隆在逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，转染人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１，筛选阳性克隆，同时以空载体ｐＬＸＳＮ和反义ｐ５３基因作为对照，免疫组化检测ｐ５３或Ｒｂ基因的表达。加入化疗药物４８ｈ后掺入３Ｈ－ＴｄＲ，１８ｈ后检测ＣＰＭ值。结果成功地构建了分别含野生型ｐ５３、Ｒｂ或反义ｐ５３的逆转录病毒载体，转染ＳＭＭＣ７７２１细胞系后获得了ｐ５３或Ｒｂ的表达；与亲代７７２１细胞相比，ｐ５３或Ｒｂ的表达阳性的７７２１细胞的生长速度均明显减慢，ｐ５３表达阳性的７７２１细胞对阿霉素的敏感性明显增强，同样条件下，Ｒｂ在７７２１细胞系内的表达则对阿霉素敏感性无影响。结论野生型ｐ５３基因转染能提高人肝癌７７２１细胞对阿霉素的敏感性     

外源性p16基因稳定转染对胶质瘤细胞周期和增殖的影响

目的：研究外源性ｐ１６基因对胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４的抑制作用,探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法：利用携带４９０ｂｐ的人ｐ１６全长ｃＤＮＡ真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人恶性胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４中,用Ｇ４１８筛选阳性克隆,以原位杂交,免疫组化方法检测ｐ１６基因在细胞转染前后的表达情况。,应用流式细胞仪,电子显微镜,生长曲线测定等方法研究ｐ１６基因对胶质瘤细胞周期,形态,生长等的影响.     

长春新碱诱导人脑胶质瘤细胞的耐药性

本文报告以细胞周期特异化疗药长春新碱（ＶＣＲ）对人脑胶质瘤Ｕ２５１ＭＧ细胞进行体外分步诱导法造成细胞的耐药性。细胞集落实验表明，经ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞Ｕ２５１ＶＲ—４０在１０～４０ｎｇ／ｍＬＶＣＲ培养液中，其细胞形成相当率是未诱导组Ｕ２５１ＭＧ细胞的２～１３倍（Ｐ＜０．０１）。同时，耐ＶＣＲ的Ｕ２５１ＶＲ—４Ｑ细胞对阿霉素（ＡＤＭ）亦有交叉耐药性，但与卡氮芥（ＢＣＮＵ）无耐药性产生。另外，５ｕｇ／ｍＬ尼卡地平（ＮＣＤＰ）能使其反转成药敏细胞。诱导过程中还发现，Ｕ２５１ＭＧ胶质瘤细胞直接在高浓度ＶＣＲ（６０ｎｇ／ｍＬ培养液中被杀伤和发生明显形态变化后，仍有少数细胞在无化疗药培养环境７～１０天可以复苏并且再增殖。研究结果不仅表明ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞能够产生多药耐受性（ＭＤＲ），而且提示该胶质瘤细胞中可能还存在一种修复微管系统的抗药机理。     

腺病毒介导的野生型p53基因表达对入胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨恢复野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建一个Ｅ１区缺失但能表达ｗｔｐ５３基因的５型腺病毒载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，该载体含有人ＣＭＶ启动子、人野生型ｐ５３基因和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号。载体经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染人胰腺癌ＰＣ－２细胞。ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实，转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的表达。结果与对照组相比，转染有Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３的ＰＣ－２细胞生长速度减慢、增殖率降低，软琼脂集落形成能力丧失。结论以腺病毒为载体恢复野生型ｐ５３在胰腺癌细胞的表达，可抑制癌细胞的生长和部分逆转其恶性表型。     

转染wt-53基因对SHG44细胞恶性表型的影

目的：转染ｗｔ－ｐ５３基因对ＳＨＧ４４细胞恶性表型的影响。方法脂质体介导法,将ｗｔ－ｐ５３基因转导入ＳＨＧ４４人胶质瘤细胞,斑点霜交证实转染成功;观察阳性转染细胞在体外常规培养中生长速率,细胞培增时间;平板集落形成率,结果转染ｗｔ－ｐ５３的细胞生长速度明显减慢,倍增时间延长（Ｐ〈０．０１）;细胞集落形成数明显减少（Ｐ〈０．０１）,结论外源性野生型Ｐ５３基因对ＳＨＧ４４细胞的恶性表型有抑制作用。     

重组P_(53)基因转染的肝癌细胞克隆株的建立及其生物学活性观察

人Ｐ５３基因位于１７ 号染色体短臂上（１７ｐ１３．１） ,编码一个由３９３ 个氨基酸组成的核磷酸蛋白,有调控细胞的生长,维持基因组的稳定,其突变、缺失在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。为进一步探讨野生型Ｐ５３ 基因的抗肿瘤特性,我室采用分子克隆方法构建了重组野生型Ｐ５３ 真核表达载体（ｐｘＴ１—Ｐ５３） ,用磷酸钙—ＤＮＡ 共沉淀法将其导入人肝癌ＨｅｐＧ ２ 细胞内,通过标记基因ＮｅＯＲ 筛选带外源Ｐ５３ 基因的Ｇ４１８ 抗药性克隆,对Ｇ４１８ 抗药性克隆细胞的生长增殖和粘附能力进行观察。结果表明,导入野生型Ｐ５３基因能使肝癌ＨｅｐＧ ２ 细胞的生长增殖速度较对照细胞明显减慢,细胞粘附能力下降。提示野生型Ｐ５３ 基因能抑制肝癌细胞的生长。本研究为肝癌的Ｐ５３ 实验性基因治疗提供了一定的依据。     

重组P53基因转染的肝癌细胞克隆株的建立及其生物学活性观察

人Ｐ５３基因位于１７ 号染色体短臂上（１７ｐ１３．１） ,编码一个由３９３ 个氨基酸组成的核磷酸蛋白,有调控细胞的生长,维持基因组的稳定,其突变、缺失在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。为进一步探讨野生型Ｐ５３ 基因的抗肿瘤特性,我室采用分子克隆方法构建了重组野生型Ｐ５３ 真核表达载体（ｐｘＴ１—Ｐ５３） ,用磷酸钙—ＤＮＡ 共沉淀法将其导入人肝癌ＨｅｐＧ２ 细胞内,通过标记基因ＮｅＯＲ 筛选带外源Ｐ５３ 基因的Ｇ４１８ 抗药性克隆,对Ｇ４１８ 抗药性克隆细胞的生长增殖和粘附能力进行观察。结果表明,导入野生型Ｐ５３基因能使肝癌ＨｅｐＧ２ 细胞的生长增殖速度较对照细胞明显减慢,细胞粘附能力下降。提示野生型Ｐ５３ 基因能抑制肝癌细胞的生长。本研究为肝癌的Ｐ５３ 实验性基因治疗提供了一定的依据。     

长春新碱诱导人脑胶质瘤细胞的耐药性

本文报告以细胞周期特异化疗药长春新碱对人脑胶质瘤Ｕ２５１ＭＧ细胞进行外分步诱导法造成细胞的耐药性。细胞集落实验表明，经ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞Ｕ２５１Ｖ＾Ｒ－４０在１０－４０ｎｇ／ｍＬＶＣＲ培养液中，其细胞形成相当率是未诱导组Ｕ２５１ＭＧ细胞的２－１３倍。     

野生型P53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的；观察野生型Ｐ５３对胃癌细胞系的生长抑制作用，方法，以逆转录病毒为载体将野生型Ｐ５３基因导入胃癌细胞系ＭＫＮ２８和ＢＧＣ８２３，检测Ｐ５６３对肿瘤细胞的影响。结果：Ｐ５３在转染细胞中表达水平提高，外源性Ｐ５３的导入使肿瘤细胞增殖细胞抗原（ＰＣＮＡ）水平明显降低；Ｇ０／Ｇ１期细胞数增加，Ｓ期降低。转染Ｐ５３基因的ＭＫＮ２８细胞裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论野生型Ｐ５３基因在与调节ＤＮＡ复制及细胞     

p16,CDK_4和PCNA蛋白在滋养细胞肿瘤中的表达

用ＳＰ法检测滋养细胞肿瘤、葡萄胎和正常绒毛中ｐ１６蛋白、ＣＤＫ４及ＰＣＮＡ的表达，发现：①ｐ１６蛋白在肿瘤中表达低于绒毛中（Ｐ＜０．０５），ｐ１６蛋白阳性标本的ＰＣＮＡ表达率低于ｐ１６阴性者（Ｐ＜０．０５）。②ＣＤＫ４表达在滋养细胞肿瘤、葡萄胎和绒毛三者间及与ＰＣＮＡ表达间无差异（Ｐ＞０．０５）。③ｐ１６阳性肿瘤患者３年存活率较高。提示ｐ１６基因突变可能是滋养细胞癌变的重要原因。检测ｐ１６蛋白表达有助于估计患者预后。     

部分肿瘤抑制基因在新建骨肉瘤细胞系SOSP-9607中的表达及意义

目的：探讨骨肉瘤细胞系ＳＯＳＰ－９６０７的发生发展与部分肿瘤抑制基因及早期生长反应基因表达的关系。方法：采用原位杂交及免疫组织化学ＳＡＢＣ染色方法检测肿瘤抑制基因p５３,ｐ１６,Ｒｂ及早期生长反应基因ｅｇｒ－１在ＳＯＳＰ－９６０７细胞中的表达;用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测肿瘤抑制基因ＤＣＣ在ＳＯＳＰ－９６０７细胞中是否缺失。结果：ＳＯＳＰ－９６０７细胞中ｐ１６,Ｒｂ基因表达未见异常改变,未检测到突变型Ｐ     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

野生型p53基因转移对心肌细胞生长的抑制作用

为了探讨野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的抑制作用及应用于高血压和肥厚型心肌病等疾病所致心肌肥厚的基因治疗可能性,本实验将野生型ｐ５３基因重组腺病毒转染体外培养的乳兔心肌细胞。应用生化染色方法,免疫组化法及聚合酶链反应技术,检测了野生型ｐ５３基因的转染效率及表达效果。采用ＭＴＴ方法及光镜技术进一步观察了野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的调节作用。结果显示,腺病毒载体能有效地将外源基因导入心肌细胞中并使     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。     

外源p53基因和TNFa基因转导对膀胱癌细胞在裸鼠体内的生长抑制

通过逆转录病毒载体将野生型ｐ５３基因、ＴＮＦａ基因单独或与ＩＬ－６基因连接（ＴＮＦＩＬ－６）分别导入膀胱癌细胞株ＥＪ和ＢＩＵ－８７．裸鼠致瘤试验和体外生长实验显示：ｐ５３基因转染组细胞接种裸鼠后９周无肿瘤生长，体外生长速率明显降低，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示Ｈ－ｒａｓ基因表达明显低于非转染组细胞，ＴＮＰａ基因和ＴＮ刊ＩＬ－６基因转染组裸鼠瘤体积明显小于对照组，体外生长速率与对照组无显著差别，两种细胞因子对Ｈ－ｒａｓ基因表达无影响。     

p16,CDK4和PCNA蛋白在滋养细胞肿瘤中的表达

用ＳＰ法检测滋养细胞肿瘤，葡萄胎和正常绒毛中ｐ１６蛋白，ＣＤＫ４及ＰＣＮＡ的表达，发现：（１）ｐ１６蛋白在肿瘤表达低于绒毛中（Ｐ〈０．０５），ｐ１６蛋白阳性标本的ＰＣＮＡ表达率低于ｐ１６阴性者（Ｐ〈０．０５）。（２）ＣＤＫ４表达在滋养细胞肿瘤，葡萄胎和绒毛三者间及与ＰＣＮＡ表达间无差异（Ｐ〉０．０５）。（３）ｐ１６阳性肿瘤患者３年存活率较高，提示ｐ１６基因突变可能是滋养细胞癌变的重要原因，检测ｐ１     

表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞体外生长的影响

目的探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞Ｕ８７ＭＧ体外生长的影响。方法构建ＥＧＦＲ反义基因表达载体，应用脂质体转染法将其导入Ｕ８７ＭＧ细胞；ＰＣＲ方法鉴定转染克隆；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交检测ＥＧＦＲ蛋白表达水平；通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义ＥＧＦＲ基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用。结果转染反义ＥＧＦＲ基因的细胞克隆株ＡＳ１ＡＳ６的ＥＧＦＲ蛋白表达水平均有不同程度的降低；ＡＳ１ＡＳ６细胞体外生长明显减慢，ＡＳ１ＡＳ６细胞克隆形成率明显降低。表明Ｕ８７ＭＧ细胞体外生长速度和恶性转化能力均与ＥＧＦＲ表达呈正相关。结论反义ＥＧＦＲ基因转染可以明显抑制Ｕ８７ＭＧ细胞生长，ＥＧＦＲ对Ｕ８７ＭＧ细胞生长具有重要的调控作用