人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在转基因烟草中的表达

实验室构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）植物表达载体并转化人根瘤农杆菌GV3101。该农杆菌以叶盘法转化烟草，建立表达t-PA的转基因烟草体系。通过对转化植株进行Southern blotting，RT-PCR，Western blotting和纤维蛋白琼脂糖平板（fibrin-agarose plate assay，FAPA）法检测，结果显示，在转基因烟草中成功地表达出有活性的人t-PA。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)基因在烟草基因组中的整合

为了建立转基因植物生产t-PA的新方法，制备了整合有t-PA基因的转基因烟草植株。通过将t-PA cDNA从质粒pGEM-tPA中切下并插入含有CaMV35S及潮霉素筛选 标记的双元载体pCAMBIA1302中，构建成植物表达载体pCA1302NS-tPA，再将重组载体转入农杆菌GV3101中，通过叶盘法转化烟草。对筛选所得的转化植株进行Southern鉴定显示t-PA基因已整合到烟草基因组中。     

过量表达铁蛋白基因的转基因烟草抗Co2＋能力分析

目的：将烟草铁蛋白基因NtFer1的完整cDNA序列克隆到植物表达载体pBI121中,利用农杆菌（Agrobactri-um tumefaciens）介导的叶盘法将NtFer1导入烟草（Nicotiana tobacum L.）基因组。对卡那抗性植株进行PCR-Southern检测,并将进一步经Northern杂交证明NtFer1基因表达量增加的转基因株系进行抗Co2＋分析。结果表明,NtFer1的过量表达提高了转基因植株的抗Co2＋能力。在含150μmol·L-1Co2＋的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为叶绿素含量、POD活性和SOD活性比非转基因株系明显增加,转基因植株MDA含量明显低于非转基因株系。结果表明,NtFer1大量表达能够增强转基因株系抗氧化能力,提高植物抗Co2＋能力。     

人β-趋化因子基因在植物细胞表达的定量测定

为了利用植物细胞作为生物反应器生产基因工程药用蛋白，将克隆的人β－趋化因子RANTES基因经Ti质粒衍生的双生表达载体导入根癌农杆菌（A.tumefaciens)菌株。通过共培养法转化烟草（N.tobacum)外植体，以抗生素筛选转化细胞并再生转基因植株。经生物素标记探针杂交确诊RANTES基因的整合，用免疫斑点印[迹法对重组基因表达水平进行定量测定。结果表明，人RANTES基因已在烟草细胞中成功地整合与表达，这为在植物细胞中大量生产基因重组药物打下了基础。     

烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶基因茎尖转化太子参的研究

以烟草为材料，对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶和Ⅰ类β-1，3-葡聚糖酶cDNA进行了克隆和序列分析，然后构建到一个双-T植物表达载体130上。用太子参无菌苗的茎尖分生组织为受体，采用农杆菌介导法进行转化。感染小苗经共培养后用除草剂筛选。然后对除草剂抗性植株进行分子检测，获得了转基因植株。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)与绿色荧光蛋白(GFP)在转基因烟草中的融合表达

构建人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的植物表达载体pCA1302NSF-tPA。将重组载体转入根瘤农杆菌GV3101中，通过叶圆盘法转化烟草。转化植株经PCR鉴定整合有t-PA基因，通过荧光显微镜可检测到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。     

人表皮生长因子在转基因番茄中成功表达

目的以转基因番茄生产人表皮生长因子(hEGF)。方法构建hEGF基因的表达载体pCAM-35S-hEGF,通过电激法转化到农杆菌菌株C58中,采用叶盘法转化番茄品系cg2002-14。结果子叶经发芽及生根诱导培养后得到了再生植株。PCR分析表明,hEGF基因已整合到番茄的基因组中。放射免疫法(RIA)测得hEGF在果实中平均含量为3.78ng·g-1。结论成功构建了hEGF基因的表达载体,获得了表达hEGF的转基因番茄植株。     

食用菌苗保护小鼠免受大肠杆菌不耐热肠毒素的攻击[英]

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和霍乱弧菌均可通过定居小肠并产生肠毒素而造成急性水样腹泻。作者用转基因马铃薯表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LT-B）制成食用菌苗,并在小鼠中评估其可行性。作者设计并构建了编码大肠杆菌LT-B的植物可接受合成基因,将该基因插入双表达载体pTH110的烟草蚀纹病毒5’非翻译区（TEV 5’UTR）和大豆vsp 3’非翻译区之间,并由花椰菜花叶病毒35S启动子转录启     

植物来源的麻疹病毒血凝素蛋白诱导小鼠产生中和抗体

本文试图验证利用转基因植物表达麻疹抗原开发口服亚单位麻疹疫苗策略的可行性。　　为了在烟草中表达麻疹病毒 ( MV)血凝素 ( H)蛋白 ,作者将 1 .8kb包含 H蛋白编码区的基因片段克隆入植物表达载体 p RTL2 ,构建了三种不同的表达载体 :p RTL 2 - H(只有 H基因 ) ;p RTL2 - H/ KDEL(增加 C末端内质网保留序列 ,SEKDEL) ;p RTL2 - SP/ H/KDEL (再增加真性 N末端的植物信号肽序列 )。将上述三种载体的表达盒转移至双元载体 p Bin1 9,分别产生 p Bin H、p Bin H/ KDEL和 p Bin SP/ H/ KDEL ,再分别将其电转化入根癌农杆…     

利用双粒病毒组复制子系统在植物细胞中表达疫苗蛋白[英]

植物源性疫苗可通过简单的方法纯化或者直接食用,因此经济而安全。这类疫苗可用转基因植物或植物病毒载体表达,但是通常较难制备能表达足够疫苗蛋白以激发免疫应答的转基因植物,此外高表达外源蛋白对植物宿主细胞有毒性。而植物病毒载体表达期短,且表达的多肽分子的大小有限。双粒病毒组表达系统具有表达水平高和表达蛋白分子不受限制的优点,已被用作基因放大系统。美国Cornell大学Hefferon等设计了一个豆黄矮双粒病毒组(BeYDV)复制子载体,包含BeYDV复制所须的顺式作用元件,在植物烟草细胞株NT-1中研究了Rep基因的放大作用。首先在报…     

丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因RNAi表达载体的构建

为研究丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因(SmHPPR)在丹酚酸类化合物生物合成中的作用,构建SmHPPR的RNAi植物表达载体。根据SmHPPR的序列,设计4对含有酶切位点的特异性引物,以丹参无菌苗叶片cDNA为模板,分别扩增两段目的基因的正反向片段(约402 bp和346 bp),经T-载体克隆并测序后,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置(正向目的片段插人中间载体pKANNIBAL内含子左侧,反向目的片段插入该载体内含子右侧),构建了含有发夹结构的RNAi植物表达载体pART27-HPPR1sa、pART27-HPPR2sa和阴性对照载体pART27-Intron。利用三亲杂交法,将这3个载体导入到发根农杆菌LBA9402中。酶切鉴定和PCR扩增结果表明RNAi表达载体构建成功并成功导入到发根农杆菌LBA9402中,为下一步研究SmHPPR基因的功能奠定基础。     

奶山羊乳腺瞬时表达溶栓药物瑞替普酶-reteplase(rPA)的研究

从人的黑素瘤细胞提取总RNA，进行RT-PCR，克隆了组织纤维溶酶原激活剂（tPA）基因，对其缺失突变，进一步克隆了溶栓药物瑞替普酶-reteplase（rPA）基因；以羊的β-乳球蛋白基因（BLG）作为调控序列，构建了瑞替普酶的乳腺表达载体BrPA。注射BrPA到乳腺动脉，收集乳汁进行鉴定和检测，体外溶栓活性分析发现瑞替普酶在羊的乳腺中获得了表达，最高表达量为8．52mg／L，为转基因动物乳腺表达载体构件的检测建立了合理的方法，也为下一步制备转基因奶山羊乳腺生物反应器奠定了基础；该研究提示，对于临床给药剂量小，而价格昂贵的药物，如细胞因子类，也许可以用这种乳腺瞬时表达系统进行生产。     

转基因烟草中一种酸性重组蛋白的纯化

烟草作为重组蛋白的植物表达宿主有其独特的优势，但还没有高得率的纯化方法。本研究从转基因烟草花叶组织中提取一种模式酸性蛋白——重组β-葡萄糖醛酸酶（rGUS）后经聚电解质沉淀、疏水色谱法（HIC）和羟磷灰石色谱（HAC）三步纯化。纯化品经SDS-PAGE显示rGUS的活性回收率约为40％。     

NTE酯酶活力域真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经病变靶标酯酶（NTE）酯酶活力域（NESP）真核表达载体，并在细胞中表达。方法利用含有特定酶切位点的引物，通过PCR扩增出其酯酶活力域，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收cDNA片段定向插入到pcDNA3．1（＋）中，通过酶切鉴定其真核表达载体的构建。然后将其转染到真核细胞中，通过NTE活力测定，检测其表达效果。结果经PCR获得了NTE的1．6kb酯酶活力域的cDNA片段，T载体克隆后测序证实完全正确，然后克隆到真核表达载体中获得了NTE酯酶活力域真核表达载体pcDNA—NEST。瞬时转染到COS7和SH-SY5Y细胞中，NTE的活力与对照细胞相比显著提高。结论成功构建了NEST真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达。     

用于中草药基因工程的双价双-T表达载体的构建

以紫外线和水杨酸诱导后的烟草为材料，对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶和Ⅰ类β-1，3-葡聚糖酶cDNA进行了克隆和序列分析，然后分别加上Hsr203J启动子和NOs终止子，依次插入到同一个双T植物表达载体130上，获得植物双价双T表达载体。经酶切和PCR鉴定证明构建的载体与预期设计的一致。     

利用基因转化提高虎杖毛状根中活性成分的含量

通过转白藜芦醇合酶(resveratrol synthase，RS)基因提高虎杖毛状根中主要活性成分——白藜芦醇(resveratrol，RE)和白藜芦醇苷(polydatin，PD)的含量。用改进的高盐低pH法提取葡萄基因组DNA，通过PCR扩增获得RS基因序列，构建表达载体pCAMBIA1300-35S-RS，然后采用冻融法转化发根农杆菌ATCC11325，继而浸染划伤的虎杖无菌幼苗叶片，PCR和RT-PCR法鉴定RS基因在虎杖毛状根中的整合与表达，高效液相色谱(highly effective liquid chromatography，HPLC)法测定转基因毛状根中RE及PD的含量。首次成功诱导获得转RS基因虎杖毛状根，经鉴定该基因已在虎杖毛状根中得到整合与表达，RE和PD的含量分别为17～187 μg·g^-1 DW和836～1 970 μg·g^-1 DW，而未转基因虎杖毛状根中RE和PD的含量分别为0～130 μg·g^-1 DW和190～320 μg·g^-1 DW。在所选取的不同根系中，转基因毛状根PD的含量均得到显著提高，最高含量是未转基因毛状根的5倍，而RE含量提高不显著。     

利用双粒病毒组复制子系统在植物细胞中表达疫苗蛋白

植物源性疫苗可通过简单的方法纯化或者直接食用，因此经济而安全。这类疫苗可用转基因植物或植物病毒载体表达，但是通常较难制备能表达足够疫苗蛋白以激发免疫应答的转基因植物，此外高表达外源蛋白对植物宿主细胞有毒性。而植物病毒载体表达期短，且表达的多肽分子的大小有限。双粒病毒组表达系统具有表达水平高和表达蛋白分子不受限制的优点，已被用作基因放大系统。     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

含绿色荧光蛋白报告基因rhPDGF-BB非融合型表达载体的构建及其转染

目的：构建并转染含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组人血小板衍化生长因子-BB（rhPDGF-BB）非融合型表达载体，为采用转基因工程化细胞修复糖尿病溃疡创面奠定基础。方法：从人脐静脉内皮细胞human umbil ical vein endothelial cell，HUVEC）中分离总RNA，行RT—PCR获得rhPDGF—BB cDNA，构建克隆质粒pMD 19-T／rhPDGF—BB，经测序正确后，再将该目的片段与真核表达载体pSELECT—GFPzeo—mcs连接，转化E．coli DH 5α感受态菌落筛选得到含GFP报告基因的非融合型表达载体，然后将其转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）并用免疫组化染色法鉴定。结果：PCR获得长度为681bp的目的片段，经pSELECT-GFPzeo—mcs载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入目的片段与GenBank检索的rhPDGF-BB cDNA序列（NM-033016）完全匹配。结论：成功构建了非融合型表达载体pSELECT-GFPzeo—mes／rhPDGF-BB，并实现了rhPDGF-BB基因在CHO的表达。     

乳腺癌组织中GST—π、TOPOⅡ的表达及临床意义

目的 从细胞水平对乳腺癌耐药机制进行探讨，以期为选择化疗方案提供参考，获得更有效的化疗效果。方法 应用免疫组化S－P法，对乳腺癌的主要耐药指标GST－π、TOPOⅡ进行检测，并结合临床分期进行研究。结果 乳腺癌中GST－π的表达为63．6％（28／44）,临床Ⅲ期表达显高于临床Ⅰ、Ⅱ期。TOPOⅡ表达为47．7％（21／44），临床Ⅲ期表达显低于Ⅰ、Ⅱ期。TOPOⅡ与GST－π表达关系间无明显相关性，说明它们各自的表达从不同方面对肿瘤耐药起作用。结论 在乳腺癌化疗药物选择时，通过联合检测GST－π、TOPOⅡ的表达具有指导作用，对判断预后有参考价值。