大鼠Müller细胞的体外培养及免疫组织化学鉴定

Müller细胞是视网膜中一种非常重要的胶质细胞.成熟的M黮ler细胞发出很多分支包围、分隔神经元的胞体和突起[1].研究表明M黮ler细胞在外伤或光损伤后可表达多种生长因子,这些生长因子除对神经元具有保护作用外[2],对细胞外环境也具有调控作用[3].因此, M黮ler细胞在视网膜中的作用正日益受到人们的重视.而M黮ler细胞的培养方法主要有组织块贴壁培养法和酶解法.本实验应用酶解法成功分离了大鼠视网膜的M黮ler细胞,并进行体外培养、免疫组化鉴定,为进一步研究胶质细胞在中枢神经系统的作用提供实验基础.     

Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压致大鼠视网膜损伤中作用

 目的 观察Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压(AOH)大鼠视网膜中变化及其抑制对视网膜损伤的影响。方法 建立大鼠AOH青光眼模型,分为正常对照(Ctrl)、AOH和AOH+玻璃体内注射胶质毒素α-氨基己二酸(AAA)后再灌注1、3和5d组,以及单纯AAA和AOH+PBS对照组。TUNEL染色检测细胞凋亡,GFAP免疫荧光染色反应Müller细胞反应性胶质化程度,Thy-1染色标记视网膜神经节细胞(RGCs)。结果 AOH可致大鼠视网膜内丛状层和内核层明显变薄、神经节细胞层内细胞排列紊乱和数量减少,并诱发Müller细胞反应性胶质化(GFAP表达增加)。同时,AAA抑制Müller细胞反应性胶质化可明显缓解AOH所致RGCs丢失和凋亡发生。结论 Müller细胞反应性胶质化参与AOH所致视网膜损伤,抑制其反应性胶质化可能是改善高眼压性青光眼视网膜病变的一种有效治疗方法。     

新生小鼠吸入高氧视网膜的血管发育与胶质纤维酸性蛋白表达的变化

目的:研究新生小鼠吸入高氧视网膜病(ROP)过程中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化规律,探讨Müller细胞与血管发育的关系。方法:实验用生后7 d(P7)C57BL/6J小鼠。ROP模型组在75%氧环境中饲养。在P9、P12、P14、P17和P21等不同时间取眼球,分别用ADP酶组织化学染色方法显示视网膜血管发育及免疫组织化学方法标记视网膜GFAP的表达。结果:小鼠视网膜血管生后开始发育,P21基本成熟;吸高氧后从P14开始出现新生血管,在P17~P21达到高峰。模型鼠视网膜Müller细胞从P14起内侧突起开始表达GFAP,到P21已遍布细胞全层。结论:高氧可导致视网膜发育晚期大量血管新生,且与GFAP表达的变化规律相一致,提示Müller细胞与视网膜血管发育关系密切。     

Nestin 和GFAP在缺氧大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达及高氧治疗的作用

目的： 探讨巢蛋白（nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在缺氧大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及高氧治疗对其表达的影响。方法: 制作大鼠缺氧模型及缺氧后高氧治疗模型,行眼球矢状位切片及视网膜铺片,行GS/nestin、GS/GFAP、GFAP/nestin免疫荧光双标染色。结果: 正常大鼠视网膜中几乎看不到nestin阳性染色,GFAP阳性染色仅位于星形胶质细胞上。缺氧后,在Müller细胞和星形胶质细胞上出现了nestin的表达,GFAP的表达没有明显变化。高氧治疗后,nestin在Müller细胞上的表达明显减弱,但在星形胶质细胞上仍有较强的表达。GFAP仍然只在星形胶质细胞上表达。结论: Müller细胞和星形胶质细胞针对缺氧损伤和高氧处理发生不同的细胞骨架蛋白重塑,这与它们和视网膜神经节细胞以及视网膜血管在解剖和功能关系上的差异有关。     

N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜感光细胞损伤模型中Müller细胞增殖和细胞因子分泌的变化

目的：建立N-甲基-N亚硝脲（N-methyl-N-nitrosourea,MNU）损伤视网膜的模型,研究视网膜神经元凋亡对Müller细胞生物学特性的影响及神经营养因子的表达变化.方法：腹腔注射MNU建立视网膜损伤模型,免疫荧光染色方法研究感光细胞缺失对Müller细胞的生物学特性的影响,并检测主要神经营养因子表达的变化.结果：TUNEL法显示,腹腔注射MNU后2 d,视网膜外核层细胞凋亡现象明显.核增殖抗原（PCNA）及细胞周期素CyclinD1的表达明显增高.与此同时,Müller细胞也开始表达神经干细胞抗原巢蛋白（nestin） RT-PCR显示胰岛素样生长因子（IGF）,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肝细胞生长因子（HGF）mRNA的表达均升高.结论：在视网膜受到损伤时,Müller细胞增殖、去分化呈现出干细胞的特性.而视网膜中IGF、bFGF和HGF等细胞因子的表达明显增高,提示视网膜损伤后可能通过大量分泌细胞生长因子,促进Müller细胞的增殖.     

高糖抑制体外培养Müller细胞生长

Müller细胞作为视网膜的重要组成部分，除了对视网膜神经细胞有支持和营养作用外，还在视网膜神经递质、钾离子、pH值的调节以及神经细胞的信号传递等方面发挥重要的作用，其改变不似可以引起视网膜血管病变，还能导致神经元的功能障碍。为研究Müller细胞在糖尿病性视网膜病变形成机制中的作用，本实验探讨高糖对Müller细胞存活和形态学的影响。     

视网膜神经血管发育及其相互影响研究进展

视网膜神经和血管分别按照各自的时间和空间顺序发育。视网膜血管发育可受到各种因素的影响,其中血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)是目前发现功能最强的眼内血管新生促进因子和抑制因子,而视网膜中的星形胶质细胞和Müller细胞则可以影响血管的生长发育。视网膜神经和血管的发育过程存在相互联系。     

Müller细胞在增殖性糖尿病视网膜病变中的最新研究进展

Müller细胞是脊椎动物视网膜中的主要胶质细胞, 其纵向跨越整个视网膜, 几乎与视网膜中的每一种细胞类型都有接触。因其独特的定位, 可以参与维持视网膜内稳态所需的各种功能。增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)是糖尿病的眼部并发症, 在炎症的作用下内皮细胞、神经元和神经胶质细胞之间相互作用造成眼底微血管病变。在PDR中, Müller细胞经历反应性胶质增生, 一方面起到保护视网膜的作用, 另一方面, 由于炎性细胞因子/趋化因子的水平升高, 可导致瘢痕和视网膜新生血管形成, 损害玻璃体。由此可见, Müller细胞胶质化对于视网膜有着双重作用。另外, Müller细胞表达低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(low density lipoprotein receptor associated protein 1, LRP1), LRP1对新生血管和炎症有着密切联系。对Müller细胞、PDR玻璃体和LRP1展开研究可能为"趋利避害"提供新思路。     

N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜感光细胞损伤模型中Müller细胞增殖和细胞因子分泌的变化

目的:建立N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N nitrosourea,MNU)损伤视网膜的模型,研究视网膜神经元凋亡对Müller细胞生物学特性的影响及神经营养因子的表达变化。方法:腹腔注射MNU建立视网膜损伤模型,免疫荧光染色方法研究感光细胞缺失对Müller细胞的生物学特性的影响,并检测主要神经营养因子表达的变化。结果:TUNEL法显示,腹腔注射MNU后2 d,视网膜外核层细胞凋亡现象明显。核增殖抗原(PCNA)及细胞周期素CyclinD_1的表达明显增高。与此同时,Müller细胞也开始表达神经干细胞抗原巢蛋白(nestin);RT-PCR显示胰岛素样生长因子(IGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)mRNA的表达均升高。结论:在视网膜受到损伤时,Müller细胞增殖、去分化呈现出干细胞的特性。而视网膜中IGF、bFGF和HGF等细胞因子的表达明显增高,提示视网膜损伤后可能通过大量分泌细胞生长因子,促进Müller细胞的增殖。     

Kir2.1通道在牛视网膜胶质细胞中的分布和表达-mRNA和蛋白水平的研究

本研究目的为在 m RNA和蛋白质水平探讨 Kir2 .1通道在牛视网膜胶质细胞中的分布和表达。从神经视网膜和视网膜色素上皮分离 m RNA和蛋白质 ,以 RT-PCR,Northern blot,Western blot和免疫荧光组织化学法检测 Kir2 .1m RNA和 Kir2 .1蛋白的表达。结果表明 ,RT-PCR扩增的 Kir2 .1c DNA产物在神经视网膜中强表达 ,在视网膜色素上皮中弱表达 ;Northern斑点杂交的 Kir2 .1c DNA仅在神经视网膜表达 ;Western斑点杂交检测 Kir2 .1蛋白单带在神经视网膜中表达 ;免疫荧光组织化学显示 Kir2 .1蛋白在 Muller细胞中分布 ,并且主要分布在 Muller细胞与神经元相接触的细胞膜区域 ,与 Muller细胞的特异性标记蛋白质抗谷氨酸合成酶抗体双重标记显示其分布特性重叠。在视网膜色素上皮未检测到 Kir2 .1蛋白的免疫活性。上述结果表明 ,Kir2 .1分布在视网膜胶质细胞的 Muller细胞 ,这种分布特性可能与完成 Muller细胞功能 -保持细胞外 K+ 的平衡、促进 K+的内流有重要关系     

高糖抑制体外培养Mnüer细胞生长

Müller细胞作为视网膜的重要组成部分,除了对视网膜神经细胞有支持和营养作用外,还在视网膜神经递质、钾离子、pH值的调节以及神经细胞的信号传递等方面发挥重要的作用,其改变不但可以引起视网膜血管病变,还能导致神经元的功能障碍[1].     

斑马鱼视网膜再生研究进展

哺乳动物视网膜损伤后仅有非常有限的自我修复能力。与哺乳动物不同,硬骨鱼类如斑马鱼的视网膜则具有旺盛的再生能力。斑马鱼视网膜损伤后,能够再生其丢失的所有类型的神经元和胶质细胞,并恢复大部分视力。研究表明,斑马鱼视网膜再生的细胞来源是Müller细胞。近年来,关于斑马鱼视网膜Müller细胞去分化及其增殖的分子机制和信号通路的研究取得了许多新的进展。我们就斑马鱼视网膜再生的研究历史、损伤模型和再生细胞来源以及调控的分子机制等做一综述。     

wortmannin对高糖视网膜Müller细胞条件培养基诱导的内皮细胞增殖和迁移的影响

目的　探讨wortmannin抗眼内新生血管形成的可能。方法　采用免疫荧光、流式细胞分析和Boyden小室迁移实验观察高糖视网膜Müller细胞条件培养基(HGMCM)诱导的内皮细胞增殖和迁移的影响。结果　50nmol/Lwortmannin可明显抑制HGMCM诱导的内皮细胞的增殖和迁移,使内皮细胞S期细胞百分率明显下降[ (37 .82±0 .57)%至(21. 91±0 .23)%,P<0 .01],G0 /G1 期细胞百分率显著升高[ (54 .57±1 .19)%至(65. 59±0. 41)%,P<0 .01],G2 /M期细胞增多(P<0 .05)。结论　wortmannin对HGMCM诱导的内皮细胞的增殖和迁移均有抑制作用,提示wortmannin具有抗视网膜新生血管形成的作用。     

外周神经节卫星胶质细胞的研究进展

<正>目前,针对胶质细胞的研究已经成为神经科学的研究主流之一,对其认识也越来越深入。在中枢神经系统中,胶质细胞具有支持和引导神经元的迁移、参与神经系统的修复和再生、形成髓鞘及血脑屏障、参与免疫应答、物质代谢和营养、以及参与神经细胞外氢离子浓度的维持等作用[1]。与之相比,有关外周神经系统胶质细胞的研究较少,本文着重综述外周神经节卫星胶质细胞研究的新进展。     

bFGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

本研究观察了碱性成纤维生长因子对胚胎神经干细胞生长和分化的影响。从孕 12 d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞 ,进行体外培养 ,分为碱性成纤维生长因子组及对照组。培养过程中观察神经干细胞的生长 ,于培养第 3、5、10 d用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达 ,以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。碱性成纤维生长因子可明显地促进培养细胞的生长和分化。免疫组化细胞计数显示 ,培养第 3 d,特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显增加 ;培养第 5 d,特异烯醇化酶阳性细胞数是对照组的 1.9倍 ,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数为对照组的 1.6倍 ,前者表达增加明显 ;培养第 10 d,两者的阳性细胞数仍高于对照组 ,但增加不明显。不同培养时间的胞体最长突起长度也均高于对照组 ;胞体直径及表面积随培养时间延长而增大。说明 ,碱性成纤维生长因子既能促进胚胎神经干细胞的生长 ,也可促使其分化为神经元及神经胶质细胞 ,尤以神经元为明显     

来源于大鼠脊髓星形胶质细胞的神经干细胞的增殖分化特性

目的:通过研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在A-NSC培养中的作用来观察其增殖特性;通过添加血小板生长因子PDGF-AA作为诱导因子来研究A-NSC分化的特性。方法:将A-NSC分四组:bFGF+EGF添加组,bFGF添加组,EGF添加组和对照组进行培养,通过形态观察和流式细胞仪检测细胞周期。同时添加PDGF-AA诱导A-NSC分化,以自然分化为对照组,通过免疫荧光染色观察比较其各类细胞分化比例的差异。结果:可观察到A-NSC在bFGF添加组和bFGF+EGF添加组有正常的分裂周期,而EGF添加组和对照组的细胞几乎都停滞在G0/G1期,显示其增殖受到阻滞;诱导实验检测到对照组细胞的分化比例分别为神经元(89.0±4.2)%,星形胶质细胞(4.6±3.2)%,少突胶质细胞(7.6%±2.5%),具有很高的神经元分化比例;诱导组细胞的分化比例分别为神经元(80.6±4.1)%,星形胶质细胞(3.0±1.3)%,少突胶质细胞(20.6±1.8)%,诱导组分化成少突胶质细胞的能力有显著提高(P<0.001)。结论:在A-NSC的生长过程中,bFGF对A-NSC的增殖起重要作用,在本实验条件下A-NSC倾向于向神经元分化,同时PDGF-AA能够显著诱导A-NSC分化成少突胶质细胞。     

糖基化终末产物对培养的兔视网膜Müller细胞bFGF表达的影响

目的:观察在不同剂量糖基化终产物(AGEs)条件下,对体外培养的视网膜Müller细胞碱性成纤维生长因子(b FGF)表达的影响及其机制。方法:采用免疫细胞化学及透射电镜方法鉴定体外培养的兔视网膜Müller细胞;应用免疫细胞化学方法半定量观察640μl/2 000μl AGEs条件下视网膜Müller细胞b FGF表达的变化;利用RT-PCR技术观察AGEs、PKC抑制剂Calphostin C对视网膜Müller细胞b FGF mRNA表达的影响。结果:640μl/2 000μl AGEs可刺激视网膜Müller细胞表达b FGF,Calphostin C可明显抑制AGEs引起的b FGF mRNA表达的增加,在浓度为50 nmol/L时其抑制作用最强。结论:AGEs刺激Müller细胞b FGF的表达,发挥促血管生成的作用,b FGF mRNA的表达可能是通过激活PKC途径实现的。     

视网膜神经胶质细胞及其分泌的细胞因子与视网膜病变

视网膜内常见的神经胶质细胞包括星形胶质细胞、Müller细胞(放射状胶质细胞)和小胶质细胞。最近研究表明,这些神经胶质细胞能释放多种细胞因子,包括VEGF、bFGF、TGF、IGF、TNF及IL等,这些细胞因子不仅在调节视网膜神经细胞生长发育中起着重要作用,而且是参与视网膜病变的重要因素。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

胰岛素对体外培养的视网膜Müller细胞VEGF变化影响的研究

目的:观察在不同浓度胰岛素条件下, 体外培养的兔视网膜M櫣ller细胞的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)表达的变化。方法:采用免疫细胞化学法和ELISA方法, 定性定量测定不同浓度胰岛素条件下体外培养的兔视网膜Müller细胞VEGF的表达水平的升高可能是胰岛素能明显增强VEGF的表达。结论:高浓度胰岛素可增强M櫣ller细胞VEGF的表达, 这种VEGF表达水平的升高可能是胰岛素促进糖尿病视网膜病变的因素之一。