培养人胎肝细胞的形态与功能研究

目的探讨人胎肝细胞分离与培养的简易方法．方法采用体外两步灌流法分离人胎肝细胞，选择条件培养液加以培养，并进行形态学和蛋白分泌功能的动态观察．结果用该法分离的肝细胞经台盼蓝拒染试验证实存活率在９５％以上，培养时间可达２周，并保持正常形态和良好的蛋白合成分泌功能．结论用酶灌流分离和条件培养的胎肝细胞性能良好，可用作肝细胞移植的供体．     

原代培养人胎肝细胞体外感染HBV的研究

目的建立HBV感染人胎肝细胞体外培养系统。方法 首先分离、培养人胎肝细胞，然后应用HBV阳性血清感染体外培养的人胎肝细胞；每隔2d收集上清液和肝细胞，应用ELISA,免疫组化法、原位杂交法和斑点杂交法检测上清液和细胞中HBsAg和HBV DNA。结果 上清液中HBsAg在感染后2d～20d均可测出，以感染后4d～16d达高峰(A值在0．22左右)。免疫组化检测细胞中HBsAg呈阳性表达，原位杂交和斑点杂交检测细胞和上清液中HBV DNA也呈阳性表达。结论 HBV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达16d。     

胎肝细胞孵育红母细胞的超微结构研究

目的探讨胎肝细胞与红母细胞的定位。方法胎肝细胞电镜观察。结果首次发现大量红母细胞被封入于肝细胞浆内。结论人及小鼠胎肝细胞能孵育红母细胞     

肝细胞生长素的研制及临床应用

近年国内已有应用“人胎肝细胞悬液”(FLC)治疗重症肝炎及慢性活动性肝炎获得较好疗效的报道。但临床广泛应用FLC尚存在两个亟待解决的问题:(1)人胎肝细胞来源困难;(2)胎肝细胞活性难以较长时间保存。我们从Labrecque氏研究肝     

人肝细胞生长因子重组腺病毒的构建及其对人胎肝细胞细胞周期的影响

目的　利用AdEasy系统构建人肝细胞生长因子 (HGF)复制缺陷型重组腺病毒 (AdHGF) ,并观察其对人胎肝细胞细胞周期的影响。方法　将质粒 pUCHGF扩增、酶切获得人HGFcDNA片段 ,插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrack巨细胞病毒 (CMV )启动子下游 ,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV HGF ,线性化后与骨架载体AdEasy 1在细菌BJ5 183内同源重组得到腺病毒质粒 pAdHGF ,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdHGF ;将AdHGF体外感染人胎肝细胞 ,以RT PCR检测HGF在胎肝细胞的表达 ;同时通过流式细胞仪测定AdHGF对胎肝细胞细胞周期的作用。结果　连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdHGF ;经 2 93细胞包装 ,3d后观察到绿色荧光蛋白 (GFP)明显表达 ,氯化铯梯度离心纯化最终获得约 4× 10 10 efu/ml滴度的重组病毒 ;AdHGF体外感染人胎肝细胞 3d后 ,HGF表达明显增加 ,流式细胞仪检测结果显示感染后的胎肝细胞由G0 /G1期向S期和G2 /M期转化。结论　利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和HGF的重组腺病毒Ad HGF ;AdHGF体外感染胎肝细胞可显著提高HGF的表达并促进肝细胞增殖 ,这将为肝细胞移植和基因治疗肝纤维化提供新的手段。     

人胎肝细胞体外感染HCV的定性研究

目的：通过定性研究探讨人胎肝细胞在体外与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）阳性血清共培养２４ｈ是否能感染ＨＣＶ。方法：人胎肝细胞在体外与ＨＣＶ阳性血清共培养２４ｈ后,采用原位ＲＴ－ＰＣＲ技术对其进行ＨＣＶ定性检测。结果：通过原位ＲＴ－ＰＣＲ技术检测,发现人胎肝细胞内ＨＣＶ正、负链ＲＮＡ均为阳性。此外,将人胎肝细胞在体外与ＨＣＶ阳性血清共培养２４ｈ并经多次洗涤后继续培养的上清液加入到新鲜分离的正常人胎肝细胞培养     

人胎肝细胞培养上清对大鼠肝细胞增殖作用的初步观察

目的观察培养人胎肝细胞分泌上清（ＦＨＣＳ）对培养大鼠肝细胞的影响。方法用相差显微镜动态观察培养大鼠肝细胞的形态变化，并用放免分析法检测其ＤＮＡ合成量。结果ＦＨＣＳ对鼠肝细胞的原代培养有明显作用，表现为大鼠肝细胞增殖活跃、生长旺盛，维持正常形态及存活时间延长，肝细胞ＤＮＡ合成量明显增加（Ｐ＜０．０１）。结论ＦＨＣＳ对体外大鼠肝细胞有明显的增殖刺激作用，该作用可能与分离、培养胎肝细胞过程中分泌产生的多种细胞因子和营养物质有关，并为早期胎肝细胞悬液治疗重型肝炎的可能机理。     

人胎肝细胞治疗重症肝炎,慢活肝和肝硬化现状

现将1989年7月“全国人胎肝临床应用研讨会”有关胎肝治疗重症病毒性肝炎、慢性活动型肝炎和肝硬化的论文概述如下: 一、人胎肝细胞治疗肝病的临床应用(一)重症病毒性肝炎:由于肝细胞再生能力很强,如果是一种既能暂时替代肝细胞的功能,又能刺激肝细胞再生和调节机体免疫的方法,则有可能降低重症肝炎的病死率。近几年,人胎肝细胞     

体外培养妊娠早期人胎肝细胞对乙型肝炎病毒易感性的变化

目的观察妊娠早期(孕10周)人胎肝细胞在不同的体外培养条件下对乙型肝炎病毒(HBV)易感性的变化，为HBV受体的发现和鉴定打下基础。方法设计无血清培养基，分别添加不同的细胞分化诱导物，在不同时相以HBV感染原代培养10周孕龄人胎肝细胞，检测细胞形态、功能及HBV感染标志物。结果培养基中添加2．5mmol／L苯巴比妥钠，培养6d后细胞逐渐出现成熟肝细胞标志，并可被HBV感染；其他培养条件下则不能观察到HBV的成功感染。结论苯巴比妥钠可在体外培养时诱导早期人胎肝细胞分化，并出现HBV易感性。     

促肝细胞生长素临床应用研究进展

自从国内陈成伟报道应用人胎肝细胞悬液治疗重型肝炎获得成效以来,人们对人胎肝疗法进行了深入的探索,主要有以下几方面工作:     

粒细胞集落刺激因子保护急性损伤人胎肝细胞的实验研究

目的建立D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)对人胎肝细胞急性损伤的模型,观察粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)对人胎肝细胞损伤的保护作用。方法分别用梯度浓度的D-GalN和不同的作用时间孵育人胎肝细胞,用四唑盐比色法(MTT法)检测细胞活性,以确定最佳的人胎肝细胞急性损伤造模条件。将胎肝细胞分为4组进行不同处理:第1组为空白对照组,第2组(G组)用G-CSF处理正常细胞,第3组(ND组)和第4组(GD组)都用D-GalN进行损伤造模,但GD组加入G-CSF作为治疗,第3组加入等量的0.9%氯化钠溶液作为实验对照。最后用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测各组细胞活性。结果当D-GalN浓度为10 mg/ml,作用时间为12 h时,可以杀伤90%以上的人胎肝细胞,并且可以保证有足够的药物反应时间。空白对照组和G组的细胞活性差异无统计学差异,但GD组细胞活性明显高于ND组(P0.05)。结论 D-GalN对人胎肝细胞急性损伤的造模条件为D-GalN 10 mg/ml作用12 h。G-CSF对D-GalN造成的人胎肝细胞急性损伤具有保护作用。     

肝细胞生长素治疗病毒性肝炎

1975年Labrccquc 从断乳大鼠的肝脏提取到一种能促进肝细胞DNA 合成的物质,命名为肝细胞再生刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)。1988年以后,我国多个单位先后从断乳大鼠、乳猪、小牛和人胎肝细胞浆中提取出具有刺激肝细胞DNA 合成、促进肝细胞再生的小分子多肽物质。分别命名为肝细胞     

人胎肝细胞混悬液临床应用进展

人胎肝细胞(FLC)混悬液应用于临床始于1958年,Uphoff首先提出:输注胎肝细胞可使放射元素所致骨髓再生障碍的基因小鼠的造血完全重建,而不发生移植物抗宿主病。从此很多学者对胎肝造血细胞的特征及治疗机理的研究表明:妊娠4～6个月的胎肝中存在着丰富的造血干细胞,而且这种造血干细胞的增殖能力,较成年人造血干细胞更     

氟致人胎肝细胞氧化应激与细胞凋亡关系的研究

目的：研究氟致人胎肝细胞氧化应激和细胞凋亡之间的关系。方法：体外培养的人胎肝细胞接触不同浓度的氟化钠24h后，检测人胎肝细胞凋亡百分率、细胞周期构成比、脂质过氧化物(LPO)、还原型谷胱甘肽(GSH)和培养液中LPO水平以及乳酸脱氢酶（LDH)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的活性。结果：氟染毒组培养液中LDH和AST活性均显著高于对照组；细胞内和上清液中LPO水平升高，细胞内GSH则明显下降，并且二者均与氟浓度呈现明显的剂量一效应关系；氟可使人胎肝细胞凋亡百分率明显升高，S期细胞数增多。结论：氟可致人胎肝细胞氧化应激，诱导细胞凋亡，一定浓度范围内的氟所诱导的氧化应激与细胞凋亡之间呈现明显的正相关关系。     

培养胎肝细胞上清对暴发性肝衰竭小鼠存活率的影响

目的探讨胎肝细胞悬液治疗严重肝病的机理以及使用培养胎肝细胞分泌上清（ＦＨＣＳ）替代的可能性．方法采用Ｄ＿氨基半乳糖（Ｄ＿ｇａｌｎ）／内毒素（ＬＰＳ）诱发小鼠暴发性肝衰竭（ＦＨＦ），观察ＦＨＣＳ的保护作用．结果ＦＨＣＳ能显著提高ＦＨＦ小鼠的存活率（Ｐ＜００１），降低血清转氨酶（Ｐ＜００５），减轻肝细胞坏死程度，并促进肝细胞再生．结论ＦＨＣＳ对ＦＨＦ有较好的保护与治疗作用，可望为已被迫放弃的胎肝细胞悬液输注疗法开辟新的途径     

微载体培养人肝细胞及肝非实质细胞

目的研究用微载体培养人肝细胞及肝非实质细胞的方法．方法采用体外简易两步灌流和差速离心法获取胎肝细胞和肝非实质细胞，在综合限定条件下进行微载体ｃｙｔｏｄｅｘ３粘附培养，并对培养肝细胞的形态及合成葡萄糖和白蛋白的功能进行动态测定．结果分离肝细胞及肝非实质细胞在接种时即呈明显的聚集倾向，将其与微载体混合振荡孵育２０ｍｉｎ后，二者极易相粘附．在被覆聚羟乙基异丁烯酸的培养瓶内，使用激素限定条件培养液培养约４８ｈ，典型的多细胞聚集球形体得以形成．该形态特征以及白蛋白、葡萄糖合成能力可保持１月结论使用微载体培养人肝细胞和肝非实质细胞具有多种优点，有广泛的应用价值．     

大黄素对原代培养小鼠肝细胞非酒精性脂肪变的影响

[目的]观察大黄素对原代培养小鼠肝细胞非酒精性脂肪变的影响。[方法]采用改良的胶原酶原位灌流法分离小鼠肝细胞,以含50%胎牛血清的1640培养液造成肝细胞脂肪变,加入不同浓度大黄素,检测培养上清液肝酶活性并观察细胞形态学变化。[结果]以50%胎牛血清的1640培养液培养的肝细胞明显脂肪变性,大黄素干预组培养上清液丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)活性较模型组显著降低,苏木精-伊红染色显示肝细胞脂肪变性减轻。[结论]大黄素可明显减轻原代培养小鼠肝细胞的脂肪变性。     

不同诱导条件对体外培养视网膜色素上皮细胞表达肝细胞生长因子的影响

目的 验证视网膜色素上皮细胞是肝细胞生长因子的分泌细胞,在蛋白水平检测不同诱导条件对人视网膜色素上皮细胞表达肝细胞生长因子的影响.方法 分别应用体积分数为0.1的胎牛血清、50%巨噬细胞调理液、与单核细胞共培养的方法 诱导视网膜色素上皮细胞,24 h后撤掉各刺激因素继续培养.通过细胞免疫化学方法 检测各种培养条件下肝细胞生长因子在视网膜色素上皮细胞中的表达情况.结果 细胞免疫化学结果 显示,有无诱导因素情况下,视网膜色素上皮细胞中肝细胞生长因子的表达均呈阳性.结论 视网膜色素上皮细胞是肝细胞生长因子的分泌细胞,有无诱导因素情况下,均分泌肝细胞生长因子.     

胎肝细胞培养上清液对小鼠急性肝衰竭的保护作用

为探讨胎肝细胞治疗重型肝炎的机制,将84只小鼠随机分为3组(每组28只),经D-氨基半乳糖/内毒素(D-galn/LPS)诱导急性肝衰竭后,分别给予生理盐水(NS)、RPMI1640培养液(RPMI)和人胎肝细胞培养上清液(FHCS)治疗,各组分别取14、8、6只小鼠进行存活率、血清谷丙酶(ALT)及肝脏病理观察。结果显示,NS组和RPMI组24小时存活率分别为14.3％和21.4％;ALT升高达207.2±41.3IU/L和188.4±52.6IU/L。FHCS组小鼠存活率为57.1％,ALT为92.5±28.7IU/L,与对照组相比差异显著(P<0.05,P<0.01)。此外,对照组分别有5(83.3％)只和4(66.7％)只动物肝组织病理改变在Ⅲ级以上,而FHCS组仅有2(33.3％)只。上述结果表明,FHCS对急性肝衰竭有保护作用,同时提示胎肝细胞分泌产物可能与保护肝细胞、治疗重型肝炎及肝衰竭的机制有关。     

培养胎肝细胞分泌上清治疗慢性重型肝炎50例疗效分析

采用培养胎肝细胞分泌上清治疗５０例慢性重型肝炎，２周后血清总胆红毒、转氨酶下降和凝血酶原活动度、白蛋白及甲胎蛋白升高例数大于对照组。３－４周后，治疗组总有效率达７２％，与对照组３８％的存活率相比，差异显著。结果表明，胎肝细胞分泌上清治疗慢重肝疗效明显，无副作用，可替代已中上上的胎肝细胞输注疗法。