HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究

目的通过HBV体外感染22周龄原代培养人胎肝细胞,比较常用检测指标的敏感性和特异性.方法利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中cccDNA.结果胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2天出现阳性,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第4天起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6天出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9天出现阳性.结论HBV在原代培养人22周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达,各种检测指标的灵敏性和特异性不一,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好,特异性可.     

乙肝病毒标志物阳性血清感染胎盘滋养层细胞的体外研究

目的提供血清中的HBV病毒能进入体外培养的滋养层细胞(HPT-8)的依据。方法用HBV阳性血清体外感染HPT-848h,设感染组和对照组。ELSIA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg,PCR检测细胞培养上清和细胞中HBVDNA,细胞免疫组织化学法检测细胞中HBsAg、HBcAg,免疫荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBVDNA的含量。结果ELISA检测PBS洗8次后第1、2代感染细胞的培养上清的HBsAg、HBeAg均呈阳性;PCR在感染细胞第1、2代的培养上清中检测到HBVDNA特异的片断;第1、2代感染细胞中检测出了rcDNA,第1代感染细胞中检测出了cccDNA;免疫组化检测感染组第2代细胞中HBsAg阳性;荧光定量PCR检测感染细胞第1、2代培养上清中HBVDNA的滴度分别为8×104拷贝/ml和4.6×103拷贝/ml,第3代<103拷贝/ml。结论血清中的HBV病毒能进入HPT-8,但在HPT-8内很难复制、繁殖。     

HBV的宫内传播与人绒毛膜滋养层细胞的HBV感染和凋亡关系的研究

目的检测HBV感染后人绒毛膜滋养层细胞的HBV标志物的表达和细胞的形态学变化,探讨HBV对滋养层细胞的感染与HBV宫内传播的关系。方法将HBV感染的血清与原代培养的人早孕绒毛膜滋养层细胞及传代细胞JEG-3共同孵育8～48h,通过倒置显微镜观察细胞的形态及细胞间连接,细胞免疫荧光方法检测滋养层细胞中HBsAg的表达,荧光定量PCR方法检测细胞中的HBVDNA,TUNEL方法检测滋养层细胞的凋亡。结果滋养层细胞与HBV感染的血清共同孵育后,滋养层细胞的形态及细胞间连接无明显变化;但通过免疫荧光方法检测到滋养层细胞中HBsAg的阳性表达,并通过荧光定量PCR方法检测到滋养层细胞中HBVDNA的存在;同时,细胞凋亡检测结果表明,与HBV感染的血清共同孵育后,滋养层细胞的凋亡数量明显增加。结论HBV可以感染体外培养的滋养层细胞;HBV感染可以诱导滋养层细胞凋亡,滋养层细胞的感染和凋亡可能与HBV的宫内传播机制有关。     

原代培养人肝细胞体外乙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒表面抗原黏附模型初探

目的研究建立人肝细胞体外乙型肝炎病毒（HBV）感染模型和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）黏附模型，为后期研究小分子抗体Fab的作用打下基础。方法体外原代培养人肝细胞，对人原代肝细胞进行HBsAg黏附实验及HBV感染实验。采用正常人胎肝细胞系（L-02）及鼠原代肝细胞进行实验对照。倒置相差显微镜下观察细胞形态，生化法检测其白蛋白分泌功能。免疫组化法检测HBsAg黏附情况和HBV感染肝细胞内HBsAg的表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝细胞感染HBV后HBsAg的持续表达。PCR检测肝细胞内HBV复制中间体-闭合环状双链DNA（cccDNA）。结果人原代肝细胞体外培养达2周以上。HBsAg黏附实验检测到HBsAg可黏附于人原代肝细胞、L-02、鼠原代肝细胞胞膜。HBV体外仅感染人原代肝细胞，从第2天起即可检测到细胞培养上清中存在HBsAg，并持续到观察结束第16天，免疫组化检测人原代肝细胞内HBsAg呈阳性；PCR检测到人原代肝细胞内存在HBV—cccDNA，而L—02及鼠原代肝细胞实验检测结果均为阴性。结论人原代肝细胞体外分离培养成功，HBsAg黏附和HBV感染模型初步建立于人原代肝细胞。     

HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究

目的 :建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验方法 .方法 :培养HepG2细胞传至 6孔板中 1 2h后 ,加2 0mL·L-1 DMSO继续孵育 1 2h .而后进行HBV阳性血清体外感染HepG2的实验 .感染组用HBV阳性血清 ,阴性对照组用HBV阴性血清 ,空白对照组用DMEM培养基 .实验开始后HepG2细胞在 2 0mL·L-1 DMSO的浓度下继续孵育 2 4h ,而后用PBS清洗 ,洗 8次 ,PBS洗后每隔 1 2h收集一次细胞培养上清 .ELISA检测细胞培养上清中的HBsAg.PCR检测细胞培养上清和HepG2细胞中的HBVDNA .结果 :HBV阳性血清感染组 ,在PBS洗后 1 2h的细胞培养上清中ELISA检测到HBsAg阳性 (A =0 .8) .PCR检测显示HBV阳性血清感染组细胞培养上清和HepG2细胞中HBVDNA阳性 ,阴性对照组和空白对照组HBVDNA阴性 .结论 :在一定条件下用HBV阳性血清进行HBV感染体外培养的HepG2细胞是可行的     

Ad-1.2乙型肝炎病毒感染HepG2细胞后HBV cccDNA的动态分析

目的 研究Ad-1.2 HBV感染HepG2细胞后HBV的复制情况.方法 携带1.2拷贝FIBV DNA的腺病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2,ELISA法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达;利用质粒抽提试剂盒提取细胞内cccDNA,经绿豆核酸酶处理后,用特异引物进行实时定量PCR检测.结果 Ad-1.2HBV感染HepG2细胞后,可有效表达HBsAg及HBeAg;感染后第1天即可在细胞内检出cccDNA,第4天达到高峰.结论 Ad-1.2HBV感染细胞,可作为抗病毒药物筛选和评价的模型.     

人胎盘滋养层细胞的分离培养及HCV体外感染试验

目的：体外分离培养较高纯度的胎盘滋养层细胞，观察其生物学特性，探讨丙型肝炎病毒（HCV）经胎盘母婴传播的具体途径。方法：采用胰蛋白酶消化法消化人足月胎盘组织，以35％，45％两个Percoll密度梯度进行分离纯化。并用免疫组化及透射电镜等技术对其生物学特性进行观察。HCV阳性血清感染体外分离培养的胎盘滋养层细胞，通过逆转录聚合酶链反应及扩增敏感试验对培养上清进行定性、定量检测，以观察HCV的感染及复制情况。结果：胎盘组织中滋养层细胞角蛋白染色阳性，血管内皮细胞及基质成分波形蛋白染色阳性，经该法分离纯化的细胞角蛋白染色阳性者（滋养层细胞）占90％以上，电镜下滋养层细胞可观察到成熟型、中间型、未成熟型三种形态。HCV感染细胞培养16d内培养上清中可间断检测出HCV RNA.结论：改进后的分离方法可以得到较高纯度的滋养层细胞，HCV感染胎盘滋养层细胞可能是HCV宫内母婴传播的途径之一。     

体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

目的：建立一种体外培养细胞内乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的检测方法。方法：Southern blot 检测HBV复制中间体,以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制;用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA（protein-free DNA,PF DNA）,经加热变性处理,EcoRⅠ酶切,然后用Southern blot检测HBV cccDNA;用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA,观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果：用Southern blot可在HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞中检测到HBV复制中间体;Hirt法提取物经变性和酶切处理,可有效地将cccDNA与其他形式HBV DNA区分开;HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞内均可检测到HBV cccDNA;HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时,其细胞内cccDNA的量较多。结论：成功建立了体外培养细胞内HBV cccDNA检测方法,该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southern blot方法,能可靠、准确地检测HBV cccDNA。     

HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的初步研究

目的：检测HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的情况，为HBV宫内传播机制研究提供理论依据。方法：用胰蛋白酶（0．25％）－DNase I(0.15U/ml)联合消化法，获取纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞。将状态良好的对数生长期人绒毛膜滋养层细胞分为6组，HBsAg-anti-HBs复合物组（I），热灭活的HBsAg、HBsAg、anti-HBc均阳性血清和高滴度anti-HBs阳性血清共同孵育物组（Ⅱ），热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清组（Ⅲ），HBsAg组（Ⅳ），热灭活的正常人血清组（Ⅴ），及正常细胞培养液组（Ⅵ，空白对照组）。分别收集各组细胞铺片，免疫组化检测细胞的感染状况。结果：所获人绒毛膜滋养层细胞纯度较高，符合后续实验要求。用鼠抗人anti-HBs免疫组化检测收集的细胞铺片，发现I、Ⅱ组均有大量HBsAg阳性信号，Ⅲ组细胞亦有少量HBsAg阳性信号出现，其他各组细胞均未发现HBsAg阳性信号。结论：体外培养的人胎盘滋养层细胞能将HBsAg-抗HBs复合物中的HBsAg，但不能将单独的HBsAg“摄入”胞内。     

乙型肝炎病毒感染正常人肾小管上皮细胞的实验研究

目的探讨正常人肾小管上皮细胞（HKC）对乙型肝炎病毒（HBV）的易感性。方法（1）体外培养的HKC传至6孔板中,接种密度为1×10^6个／ml,孵育24h后分受感染和阴性对照两组。受感染组加入0．5mlHepG2．2．15细胞上清液（已知该体外培养的细胞系可随细胞传代释放HBV病毒颗粒）;阴性对照组加入015mI10％FCS—DMEM／F-12培养液。两组HKC继续孵育72h,消化、离心沉淀,PBS清洗,实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测两组HKC中的HBVDNA。（2）将HKC细胞传代并接种至2个6孔板中盖玻片上制作细胞爬片,接种密度为1×10^6个／ml,24h后行HBV感染实验。然后将两个6孔板分别作为：（1）受感染组：往六孔板中加入制备好的感染用HepG2．2．15细胞上清液2ml;（2）阴性对照组：往六孔板中加入2mI10％FCS—DMEM／F－12培养液。将HepG2．2．15细胞分别传代并接种至6孔板中盖玻片上制作细胞爬片,接种密度为1×10^6个／ml,24h后作为阳性对照组：往六孔板中加入2ml10％FCS—DMEM培养液继续孵育72h,原位杂交检测各组中的HBVDNA。结果实时荧光定量聚合酶链反应检测到受感染组HKC的基因组中HBVDNA的存在,受感染组HKC原位杂交检测HBVDNA阳性,呈核型。结论体外培养的正常HKC对HBV易感。