血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的：构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法：实验于2004—02／12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成，表达质粒由中山大学医药分子实验室保存，肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因，连接PGEN-T载体，在16℃下以进行16h连接反应，转化大肠杆菌DH5α，对所获克隆扩大培养，提取质粒经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切鉴定。将带有插人片段的重组质粒命名为PGEN-Tendo。对其阳性克隆扩大培养，大量提取质粒，以T7，SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEN-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切后定向连接，转化人大肠杆菌DH5α，聚合酶链反应鉴定阳性克隆，命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养，经42℃热诱导4h后收菌，对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎，将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果：反转录-聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp。用EeoRⅠ，BamHⅠ双酶切，10g／L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEN-T载体片段，说明内皮抑素已成功构建在PGEN-T载体上。经全自动正、反向测序，Genbank分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因，该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A，但编码的氨基酸都是精氨酸，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，出现特异性蛋白质条带，大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达，表达量为14．5％。结论：克隆的552bp的内皮抑素基因，经与GenBank中人胶原ⅩⅧcDNA中内皮抑素基因比较，基因序列基本一致，说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达，为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

体外重组内皮抑素及其抑制肿瘤血管生成机制探讨

目的克隆及表达中国昆明种小鼠的内皮抑素（endostatin）基因。方法RT-PCR方法扩增鼠内皮抑素基因，构建温敏型表达载体pBV220-endostatin，在大肠杆菌DH5“中诱导表达出鼠内皮抑素蛋白。结果筛选出pBV220-endostatin阳性克隆菌株，诱导表达外源蛋白内皮抑素，纯化复性后具有一定生物学活性。结论克隆小鼠内皮抑素基因，重组内皮抑素在大肠杆菌中高效表达，复性后具有抑制血管生长活性。     

重组人内皮抑素基因克隆及其质粒抑瘤活性的鉴定

目的：利用大肠杆菌表达系统表达重组人内皮抑素，并将其作用于小鼠宫颈癌动物模型，检测其效果。方法：采用RT－PCR方法从人胚肝中提取人内皮抑素cDNA，将其克隆入pGEM-T Easy克隆载体中；经全自动序列分析仪测序确证后，将人内皮抑素cDNA亚克隆入原真核表达载体PQE－30，构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒；将该重组质粒注射入小鼠宫颈癌模型。结果：成功获得551bp人内皮抑素基因，测序证实序列正确。构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒，此质粒能有效抑制肿瘤生长。结论：人内皮抑素具有抗肿瘤生长作用，为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

乳腺癌相关分子人乳腺珠蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]克隆乳腺癌相关分子人乳腺珠蛋白（hmnan mammaglobin，hMAM）基因并诱导其表达，为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础，从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。[方法]从乳腺癌组织提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增hMAM基因编码序列．将扩增产物克隆至PGEM-T载体中，DNA测序。用限制性内切酶切下目的基因，与相同酶切的表达载体pQFA0连接、筛选、鉴定，构建pOE40-hMAM融合表达质粒，以硫代半乳糖苷（IPTG）诱导在大肠杆菌M15中表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达结果.[结果]琼脂糖凝胶电泳显示聚合酶链反应（PCR）扩增产物的分子量大小与预期相符。对重组质粒分析表明，插入片段的序列与文献报道hMAM基因编码序列一致。在IPTFG的诱导下，M15重组菌高效表达出一个相对分子质量约为34kD的产物。[结论]重组表达质粒pQE40hMAM表达成功。     

以ECHO克隆系统构建人生长激素的哺乳动物表达载体

目的:构建ECHO克隆系统构建人生长激素的哺乳动物表达载体,以克服原核生物表达系统生产人生长激素存在的缺陷。方法:实验于2002-08在解放军广州军区广州总医院医学实验科进行。①先把人生长激素基因片段克隆到ECHO系统的供载体中,构建供载体pUni/Lox-HGH。②让该供载体与具Lox位点的受载体在Cre重组酶的作用下融合,构建出人生长激素的哺乳动物表达载体pcDNA4.1/pUni-HGH,使人生长激素基因处于CMV启动子的调控下,EcoRI单酶切及BamHI/EcoRI双酶切鉴定重组质粒。结果:由琼脂糖凝胶电泳和序列测定证实,用ECHO克隆系统构建的融合质粒中,确实含有人生长激素带内含子的基因序列。结论:用ECHO克隆系统可以构建人生长激素的哺乳动物表达载体,且方便、快捷,为取代原核生物表达系统生产人生长激素,提供了依据。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

骨形成发生蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的：克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法：根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用bnestep RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5a进行克隆筛选鉴定及测序。结果：琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示-长约456bp的条带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约456bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论：利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4.0的重组质粒

背景:研究表明柯萨奇B4病毒感染与1型糖尿病发病有关,但目前尚未明确其关系的确切机制.目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4.0的重组质粒,转入大肠杆菌中表达,并对表达产物进行功能鉴定.设计、时间及地点:随机对照实验,于2007-03/08在吉林大学免疫学教研窒完成.材料:CVB4、HeLa细胞病毒均为吉林大学病原生物教研室保存;菌株E.coli DH5α与M15为东北师范大学遗传所保存;质粒PUCm-T载体、PQE4.0载体由东北师范大学曾宪录教授惠赠.方法:提取柯萨奇B4病毒总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增非结构蛋白P2C基因,与PUCm-T载体连接,将PUCm-T-P2C质粒进行BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切,同收目的片断并定向克隆到PQE4.0表达载体中酶切鉴定.将PQE4.0-P2C 阳性重组质粒转化大肠杆菌M15,在IPTG诱导下表达.主要观察指标:①以十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C的表达.②采用淋巴细胞转化实验和酶联免疫吸附实验检测大肠杆菌M15细胞重组蛋白粗提物.结果:①反转录-聚合酶链反应扩增得到的987 bp的cDNA片段,克隆入PUCm-T载体,酶切释放出长度约2773 bp和987 bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,序列分析与Genbank 报道的序列一致.目的片段克隆入PQE4.0载体,酶切释放出长度约3 400 bp和987 bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,获得PQE 4.0-P2C重组表达质粒.②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示未诱导组无明显蚩白带,而诱导组在31 000位置均出现较明显的蛋白带,且随着诱导时间延长蛋白表达量也随之增加.③淋巴细胞转化实验与酶联接免疫吸附试验测定结果表明,表达产物具有良好的抗原性与特异性.结论:柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C在大肠杆菌中高效表达,且表达产物具有一定的免疫活性.     

人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人向血病抑制因子（LIF）和血管内皮生长因子165（VEGF165）对脊髓损伤后神经元存活有重要作用.病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法.目标：构建双基因共表达载体plRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定.方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2-EGFP多克隆位点构建成为plRES2-LIF-EGFP.人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES（即内部核糖体进入位点）的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体.通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达.结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp.构建的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/Notl双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/ Notl双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段.RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白.结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体.     

大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定

目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450。方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成。提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因。并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定。BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450。结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因。重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1461bp的酶切产物。测序的结果用ClustalW在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源。阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带。对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1461bp和5900bp两条特异性条带。结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础。