抗苗勒管激素的单克隆抗体制备与鉴定

目的表达高纯度的抗苗勒管激素蛋白,以该蛋白作为抗原制备单克隆抗体,并鉴定抗体亚型,为进一步开发优质的抗苗勒管激素诊断试剂盒做技术储备。方法在表达载体pET-28a(+)质粒中接入经密码子优化的抗苗勒管激素基因(AMH)片段,转化于BL21细菌中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白大量表达,对上清中可溶性蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度。经纯化的抗原蛋白3次皮下免疫小鼠,挑选产生高效价的抗体的小鼠,取其脾细胞,制备悬液。经细胞杂交技术与骨髓瘤细胞进行融合,筛选能稳定持久分泌抗AMH抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水抗体。通过亲和层析技术、BCA蛋白检测方法等测定手段,纯化抗体、检测抗体浓度。结果筛选到2株能持久分泌抗AMH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为克隆细胞株3F6和4E7,分泌抗体均为IgG1亚型。结论筛选出稳定分泌高纯度的抗苗勒管激素抗体的2株杂交瘤细胞,并制备单克隆抗体。下一步将其应用于AMH检测试剂盒的开发。     

H7N9禽流感病毒血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制用于H7N9禽流感病毒诊断的血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体。方法采用H7N9禽流感病毒血凝素特异性线性B细胞抗原表位免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术和间接ELISA法筛选、鉴定获得稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA和斑点免疫印迹技术鉴定其亚型、效价、纯度等生物学特征。结果共获得2株单克隆抗体(7C8H8和8E9E2),其中7C8H8抗体亚类为IgG2a,腹水抗体效价>1∶512000,且可以特异性结合H7N9禽流感病毒血凝素。8E9E2仅具有较低的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白结合力。结论获得1株可分泌高效价、高特异性的抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株7C8H8。     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为提高弓形虫感染的特异性免疫诊断水平，作者用杂交瘤技术制备抗弓形虫单克隆抗体（McAb）。经有限稀释法克隆3次和2个月的连续传代及液氮保存试验，获得6株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株。其培养上清SPA—ELISA效价高者达1:6250，能被特异性抗弓形虫血清所阻断，证明该McAb具有抗弓形虫的特异性。     

出血性大肠杆菌单克隆抗体的制备与鉴定

以肠出血性大肠埃希氏菌 (EnterohaemorrhagicE .coli,EHEC)O15 7∶H7免疫Balb c小鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2 0融合、筛选 ,经 3次亚克隆建立了一个稳定分泌抗大肠杆菌O15 7单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 3A5。分泌抗体属IgM亚型 ,腹水的抗体效价达 1∶1× 10 6 。以辛酸 饱和硫酸铵法纯化后抗体的工作浓度为 1∶2× 10 4 ,检出限为 10 5～ 10 6 cfu ml。该抗体对大肠杆菌O15 7有较高特异性 ,同时抗出血性大肠杆菌O113∶H2 1抗原     

环丙沙星单克隆抗体制备、纯化及鉴定

目的制备抗环丙沙星单克隆抗体.方法用碳二亚胺(EDC)法合成的环丙沙星-牛血清白蛋白完全抗原(CPFX-BSA)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选分泌抗环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果筛选出3株分泌抗环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D10、3C6和3G7,其抗体类型分别为IgM、IgG1和IgG1.其中3C6腹水抗体纯度、抗体浓度、亲和常数分别为80.04%、3.96 g/L和1.01×108 L/mol.该单抗与恩诺沙星、诺氟沙星的交叉反应率分别为125.89%、19.50%,与青霉素、卡那霉素和庆大霉素等无交叉反应.结论该单抗可用于动物性食品中CPFX残留ELISA检测方法的建立.     

鳙鱼变应原小清蛋白单克隆抗体制备及鉴定

目的制备、纯化及鉴定抗鳙鱼小清蛋白单克隆抗体。方法以重组鱼主要过敏原小清蛋白(parvalbu-min)为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1,半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体,间接ELISA方法和w estern blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性;采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。结果共获得抗parvalbumin细胞株7株,1G1,1B5,1A5,2B9,1H4,1B7,1G3。1G1、1B7、1A5、1H4和1G3效价均高于1∶400 000,P/N>2.1;1B5效价高于1∶200 000,2B9效价较低;Western blot检测表明所有抗体均能识别parvalbumin;抗体亚类为IgG1型,1G1,1A5,2B9,1H4,1B7特异性结合parvalbumin,与其他种类过敏原无交叉反应,1G3和1B5与虾和大豆过敏原有交叉反应性,P/N>2.1。结论获得高效价抗体5株,发现parvalbumin与虾、大豆过敏原存在交叉反应性,为建立parvalbumin检测体系提供依据。     

抗软海绵酸单克隆抗体的制备

目的利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗软海绵酸(OA)的单克隆抗体(McAb).方法用碳化二亚胺法将半抗原OA与牛血清白蛋白(BSA)制备成完全抗原OA～BSA,用OA-BSA免疫BALB/c小鼠,使小鼠脾细胞产生抗OA的抗体.在聚乙二醇的作用下,使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合在一起,融合后的细胞用HAT选择培养,最后用ELISA法筛选出分泌抗OA McAb的杂交瘤细胞株.结果用碳化二亚胺法成功地将微量半抗原OA与BSA和卵清白蛋白(OVA)制成了完全抗原OA-BSA和OA-OVA.免疫小鼠血清中抗OA的抗体呈现阳性反应,表明小鼠脾细胞产生了抗OA的抗体.经3次抗体检测筛选出3株分泌抗OA MCAb的杂交瘤细胞株.结论抗OA McAb的成功制备为建立快速、经济的软海绵酸ELISA检测方法打下了坚实的物质基础,也为其它贝毒素检测方法的研究提供了可借鉴的经验.     

抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的制备及特性

目的研制能够与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2有较好交叉反应的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体。方法利用B细胞杂交瘤技术,建立分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。结果建立了1株稳定分泌抗总黄曲霉毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G2。该细胞株所分泌的单克隆抗体Ig亚类为IgG1,参考工作浓度为1∶1.6×106,亲和力常数为8×10-8mol/L。该抗体与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应分别为100.0%、57.5%、104.0%和19.0%,与其他真菌毒素无交叉反应。结论制备出能分泌具有高特异性和亲和力的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

甲基对硫磷单克隆抗体的研制及鉴定

目的研制甲基对硫磷(M1605)单克隆抗体(McAb).方法人工抗原M1605-TTH免疫BALB/C小鼠,用被免疫的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在融合剂PEG4000作用下融合.经过HAT培养液选择性培养、间接ELISA法筛选和有限稀释克隆后,鉴定该杂交瘤细胞株和McAb.结果获得2株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株G12、H02,其培养液和腹水滴度为1103和1105.进一步研究G12发现,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108,其McAb分类为IgM,该McAb的亲和力常数为1.67×105L/mol,且具有较好的特异性.结论获得抗M1605的特异性McAb,为建立M1605简便、快速、特异的生物检测方法提供了必要条件.     

Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用

建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用.将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合.经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力.采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域.Westem blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性.经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgG1;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段.Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1.该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础.     

对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定

重氮化法使对氧磷（Ｅ６００）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、血蓝蛋白偶合合成人工抗原。用人工抗原Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,然后将ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞和Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾脏细胞融合,成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测。上述杂交瘤细胞连续传代或冻存１０周,其分泌抗体水平稳定     

分泌抗重组葡激酶单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的 建立分泌抗重组葡激酶（r-SAK)单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法 采用3种方法以r-SAK免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞做细胞融合。结果 经筛选和克隆化后获得10株抗r-SAK单克隆抗体杂交瘤细胞。结论 建立的分泌抗r-SAK单克隆抗体杂交瘤细胞株具有高度特异性，在r-SAK的研制中有很高的应用价值。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定抗T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,以期为T-2毒素的快速检测提供有力的抗体工具。方法:采用琥珀酸酐法将T-2毒素活化为T-2HS,T-2HS在DCC与NHS作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联合成完全抗原。以T-2HS-BSA为抗原,免疫BALB/c小鼠,用ELISA筛选、建立分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株。测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接竞争法检测单克隆抗体细胞株的特异性。结果:建立了1株稳定分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株T-1B3,该细胞株所分泌的单隆抗体Ig亚类为IgG1,ELISA检测结果表明抗T-2毒素抗体可以与T-2毒素发生特异性反应,工作浓度为1:6.5×104,IC50为3.6 ng/ml。该抗体与HT-2毒素的交叉反应为65.9%,与黄曲霉毒素无交叉。结论:制备出能分泌具有较高特异性和亲和力的抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

[目的]制备毒死蜱单克隆抗体,为建立毒死蜱残留检测方法奠定基础。[方法]以毒死蜱原药与3-巯基丙酸为起始原料,合成半抗原并对其进行结构鉴定。利用该半抗原与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原,再取已免疫的经过筛选的Balb／c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定,并测定与其他农药的交叉反应率。[结果]获得两株稳定分泌毒死蜱单克隆抗体的细胞株,其检测范围为0．04～0．42mg／L,半数抑制浓度为0．135mg／L,最低检测限为0．03mg／L,与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷几乎没有交叉反应。[结论]成功制备两株分泌毒死蜱抗体的单克隆细胞株,初步建立了毒死蜱间接ELISA检测方法。     

抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其特性的初步研究

将用合成的匙孔形虫戚血蓝蛋白－甲醛－河豚毒素（ＫＬＨ－ＨＣＨＯ－ＴＴＸ）连接物免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Ｓｐ２／０融合，经３～４次亚克隆，建立了３个稳定分泌抗河豚毒素的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ｇ３、４Ｇ３、６Ｄ９。其中１Ｇ３和４Ｇ３分属ＩｇＧ２ｂ亚类，６Ｄ９属ＩｇＧ１亚类。腹水的抗体稀释度为１∶１０５～１：５×１０６。用竞争抑制性酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）测定三种抗体的最低反应浓度为１×１０－３ｍｇ／Ｌ。     

Determination of circulating filarial antigen using monoclonal antibody against Brugia malayi adult worm ES antigen with Dot-ELISA

A hybridoma cell line secreting monoclonal antibody (McAb) against Brugia malayi adult worm excretory-secretory antigen (AWES) was established. The identification of the Ig sub-classes showed that McAb AWES belongs to IgG. We developed a Dot-enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) to detect circulating parasite antigens in human lymphatic filariasis. 75 of 77 (97.4%) bancroftian microfilaremia cases showed positive reaction. 27 out of 40 (67.5%) microfilarial patients with hydroceles, chyluria, or elephantiasis, and 20% of sera from asymptomatic residents of filariasis-endemic areas evidently contained filarial antigens. 31 of sera from non-endemic area with ascaris infection were all negative. The minimal amount of antigens in pool normal sera adding AWES antigen was detectable at 6.3 pg/ml. The results suggested that Dot-ELISA is a sensitive, specific, cheap and simple agent for use in epidemiological field studies.     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与中和效应

用提取的Ａ型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合和克隆化，经ＥＬＩＳＡ筛选，共获得７株稳定分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ａ８、１Ｃ３、１Ｄ５、１Ｄ８、１Ｆ１、１Ｈ１和２Ｅ３。经鉴定，７株ＭｃＡｂ的Ｉｇ亚类有ＩｇＧ１（１Ｄ８）、ＩｇＧ３（１Ａ８、１Ｃ３和２Ｅ３）和ＩｇＭ（１Ｄ５、１Ｆ１和１Ｈ１）。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为：１∶５１２～１∶１０２４和１∶１０６～１∶１０８。尤为重要的是，２Ｅ３杂交瘤细胞株分泌的ＭｃＡｂ不仅能够中和α毒素的磷脂酶Ｃ活性和溶血活性，而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用     

抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体的稳定性观察

目的了解抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体的稳定性。方法应用杂交瘤技术获得3株分泌抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体细胞株1A9、1B1和1D4,通过ELISA与血凝抑制试验测定其单克隆抗体的稳定性与特异性。结果3株细胞连续传代9个月,能稳定地分泌单克隆抗体,经不同冻融时间观察其A值无明显改变并且与甲3,甲1型流感病毒呈阳性反应,与乙型流感病毒,腺病毒呈阴性反应。结论抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体具有很好的稳定性与型特异性。在流感病毒的病原学诊断方面有实用价值。