戊型肝炎病毒TaqMan Real-time RT-PCR法的建立及应用

目的 建立灵敏、特异、稳定的戊型肝炎病毒(HEV) TaqMan Real-time PCR检测方法.方法 根据GenBank中的HEV相关序列,选取HEV基因组ORF2的保守区域设计合成特异性引物和探针,建立TaqMan HEV Real-time RT-PCR检测体系,评价体系的特异性、敏感度和稳定性,并应用于临床样本的检测.结果 本研究建立的HEV Real-time RT-PCR检测体系最低检测极限达到10个拷贝/反应,重复性实验Ct值的变异系数(CV)最大为1.53％,并且该体系能特异检测出戊肝临床样本中的HEV,其拷贝数从1.87×104拷贝/ml到8.12×106拷贝/ml不等.结论 成功建立特异性强、灵敏度高的HEV Real-time RT-PCR检测方法,应用于临床样本检测时取得了良好效果,为HEV分子病原学诊断打下基础.     

甲肝病毒特异性TaqMan荧光定量PCR法检测甲肝病毒核酸的研究

目的 建立甲肝病毒(HAY)特异性TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对血清等样品中的HAV进行检测.方法 根据参考文献,选取HAV基因组保守区5'-NCR区引物和探针,建立特异性强、敏感度高、稳定性好的TaqMan HAV Real-time RT-PCR检测体系并应用于甲肝患者血清等病毒核酸的检测.结果 本研究建立的方法能够特异检测出样品中的甲肝病毒,其灵敏度介于每反应0.1CCID50至0.01CCID50之间.同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大2.0％,批间样本Ct值的变异系数最大2.6％.急性期甲型肝炎患者血清中甲肝病毒为5.18×102～4.93×107拷贝/ml.结论 本实验建立的HAV Real-time RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,可成功应用于临床样本等甲肝病毒的病原学检测.     

辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立

目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法。方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBRGREENΙ荧光PCR和常规RTPCR扩增,并对SYBRGREENΙPCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃,最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBRGREENΙ荧光PCR方法进行检测。结果SYBRGREENΙ荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1PFU/ml。对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响。对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性。结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段。     

Kadipiro病毒TaqmanReal—timePCR检测方法的建立

目的利用TaqManReal—timePCR技术，建立Kadipiro病毒（KDV）实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank发表的KDV基因序列资料分析结果，在其第12片段基因区段设计KDV特异引物与探针，利用14株不同科属病毒核酸验证方法特异性，重复实验检验方法稳定性，利用体外转录的定量RNA标准品建立基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针具有良好的特异性，同一样品重复检测D值的变异系数均〈1．8％，定量分析模型的灵敏度为100拷贝／反应。结论建立了一种特异、灵敏、高效的KDV一步法TaqManReal-timePCR检测方法，为今后该病毒的监测与研究工作提供技术手段。     

锁核酸捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应构建及检测乙型肝炎病毒DNA

建立和检测新型乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测技术锁核酸(LNA)捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应(PCR)。方法 2009年8月至2010年3月选取本院20例健康献血者和肝病专科住院的75例经COBAS Amplicor检测HBV DNA阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,分别采集血液样本进行LNA捕获TaqMan探针实时PCR特异性试验。同时对LNA-实时PCR方法的重复性、特异性和线性范围等进行分析。结果 其线性范围为10～2.3×109 IU/ml。将10 IU/ml作为检测下限,具有95％可信区间。线性回归分析显示其斜率接近1.0 (R2=0.999)。批内变异值为3.88％～4.36％,批间变异值为8.5％～11.7％。20例健康献血者的阴性对照血清HBV-DNA检测均为阴性,而75例经COBAS Amplicor检测HBV DNA阳性患者的血清样本除1例阴性外,其余都为阳性。结论 LNA捕获TaqMan探针实时PCR方法为HBV-DNA检测的一种快捷灵敏、准确度高的新方法,值得临床实验室推广应用。     

建立人微小病毒B19的PCR检测方法

人微小病毒Ｂ１９是微小病毒科中唯一能感染人的病毒。能够提供Ｂ１９抗原的病毒体外培养系统尚未建成，因此限制了血清学实验的开发和普及。为此作者建立起Ｂ１９病毒的ＰＣＲ检测方法。设计引物在表达外壳蛋白ＶＰ１基因区，扩增长度为４００ｂｐ。     

采用TaqMan MGB探针定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70变异

目的 建立一种定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70位点主要野生株（Arg-CGG,70w）和变异株（GIn-CAG,70M）的方法.方法 设计一对分别针对70 W和70 M的TaqMan MGB探针,建立一种实时逆转录聚合酶链反应定量检测方法.验证方法的敏感性、特异性和准确性.结果 所设计的引物和探针具有良好的特异性,敏感性可达5拷贝/反应.进一步的克隆测序证实了新方法的可靠性.结论 建立了一套HCV 1b亚型C区氨基酸70变异的定量检测系统,具有较高的敏感性、特异性和准确性,为研究70 W和70 M在抗病毒治疗中的动态变化提供了技术手段.     

扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒的核酸检测方法,以期用于埃博拉出血热临床标本的检测.方法 针对扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因设计引物和探针,建立单重和双重实时荧光RT-PCR检测方法,利用体外转录病毒RNA和埃博拉病毒系列参考品RNA评价其敏感性,利用马尔堡病毒、健康人、登革热患者和发热伴血小板减少综合征患者血清评价其特异性.结果 所建立的实时荧光RT-PCR检测方法扩增效率在95％～105％,可特异性地检测扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因,与马尔堡病毒、登革热和发热伴血小板减少综合征病毒均无交叉反应,体外转录的病毒RNA可检出10～100拷贝/μl.双重检测方法通过细胞培养的扎伊尔型埃博拉病毒RNA验证,可检出100 pfu/ml病毒.结论 本研究建立的检测扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于埃博拉出血热临床标本的检测.     

甲型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的设计和检定

目的　设计甲型流感病毒TaqMan荧光RT-PCR检测方法并对其进行检定。方法　用DNAStar和PrimerPremier5. 0软件设计甲型流感病毒荧光PCR检测所用引物和探针 ;在GenBank中进行Blast以及电子对比证明其具有高度的特异性和保守性 ;和标准RT-PCR进行比较 ,检测此方法的灵敏度。结果　所设计的引物和探针高度特异和保守 ,灵敏度比标准RT-PCR方法高 3～ 27倍 ,并且反转录和PCR可合并为一步。结论　设计了甲型流感病毒TaqMan检测方法 ;该方法具有特异、灵敏和简便的特点     

A hemi-nested PCR assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid

This paper is the first to describe the development of a hemi-nested PCR assay for the detection of vesicular stomatitis virus (VSV) nucleic acid. This assay was developed as it combines high sensitivity for virus genome detection with the identification of the external amplification product in the reamplification step, thus confirming the specificity of the reaction. The assay did not depend on the presence of infectious virus in samples, as demonstrated by its detection of VSV in blood samples which were non-infectious in tissue culture. One further advantage was that the VSV-New Jersey and VSV-Indiana serotypes could be differentiated through the selective use of the appropriate hemi-nested primer. This assay is ideal for the study of VSV pathogenesis and persistence.     

Detection of Pneumocystis jirovecii by PCR in patients with lung cancer: A preliminary study

IntroductionInfection complications in lung cancer (LC), one of the most common cancers in the world, are still among the most important causes of death. Of them, P. jirovecii, which is as an opportunistic infection, causes a life-threatening type of pneumonia in cancer patients. This preliminary study aimed to determine the incidence and clinical status of P. jirovecii by PCR in lung cancer patients compared to the conventional method.Material and methodsSixty-nine lung cancer patients and fSorty healthy individuals were included in the study. After sociodemographical and clinical features were recorded, sputum samples were collected from attenders. Firstly, microscopic examination was made with Gomori's methenamine silver stain and then PCR was performed.ResultsP. jirovecii was detected in three of 69 lung cancer patients by PCR (4.3%), but not by microscopy. However, healthy individuals were negative for P. jirovecii by both methods. Based on clinical and radiological findings, P. jirovecii was evaluated as probable infection in one patient and colonization in the other two patients. Although PCR is more sensitive than conventional staining methods, it cannot distinguish probable and proven infections from pulmonary colonization.DiscussionIt is important to evaluate the decision of infection together with laboratory, clinical and radiological findings. Moreover, PCR may enable to know the colonization and to take precautions such as prophylaxis, due to the risk of colonization turning into an infection in immunocompromised patient groups. Further studies involving larger populations and evaluating the colonization-infection relationship in patients with solid tumors are needed.     

Detection of multiple melanoma-associated markers in melanoma cell lines by RT in situ PCR

New surgical oncology techniques, such as lymphatic mapping and sentinel node biopsy, require precise identification of the presence of even very small numbers of tumor cells. The gold standard for such analysis remains microscopic assessment of tissue sections, stained conventionally or by immunohistochemistry for appropriate tumor markers. This approach is limited by sampling constraints and requires a high degree of expertise from the microscopist. Recent studies have demonstrated a subgroup of patients whose sentinel nodes are negative on microscopy, but whose nodes yield an enhanced signal for melanoma markers when evaluated by RT-PCR. These enhanced signals reflect a mixture of signal sources, including small numbers of melanoma cells and cells other than melanoma cells that express the relevant markers(s). Because the preparative techniques for RT-PCR destroy the structural integrity of the tissues and disrupt individual cells, the exact cellular source of enhanced signal from a tissue cannot be demonstrated by conventional RT-PCR. RT in situ PCR, in which the RT-PCR technique is applied on a tissue section, does identify the cells that are the source of signal. We have attempted to optimize this interesting approach and have applied it to the detection of relevant melanoma markers in tissue culture lines.     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

肠道致病菌PCR检测与鉴定研究

目的 为了实现对腹泻等病原菌的快速、准确检测与鉴定，对引起感染性腹泻的暴发与流行的常见肠道致病菌进行检测与鉴定方法研究。方法 将常规ＰＣＲ与半套式ＰＣＲ及随机引物扩增ＤＮＡ多态性分析（ＲＡＰＤ）等技术相结合，对常见肠道致病菌，如志贺菌、沙门菌和致病性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７等进行检测与鉴定。结果 ｕｉｄＡ引物可特异扩增沙门菌、志贺菌及大肠杆菌，而３种特异性引物则只扩增相应的致病菌；第一次ＰＣＲ敏感性     

聚合酶链反应检测乙型肝炎患者肾组织中的HBV DNA

应用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对１１例乙型肝炎患者石蜡包埋的肾、肝组织中的ＨＢＶＤＮＡ进行了检测，并与其免疫组化及原位杂交结果作了比较。二组引物检测的结果表明：在肝组织中均有ＨＢＶ的感染，其中５例存有ＨＢＶ的复制；倚组织中ＨＢＶＤＮＡ的检出率为８／１１（７２．７％），未检测出有ＨＢＶ的复制，包括２例有膜性肾炎和膜增生性肾炎病变的病例。ＨＢＶ可以感染肾组织但并不在肾组织中复制。这一实验结果较为支持乙型肝炎患者肾脏出现的病变可能系沉积于肾小球内的免疫复合物介导损伤的结果。     

产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对O1群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。 方法根据O1群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因rfb-O1和霍乱肠毒素的A亚基编码基因ctxA的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用便携式Smartcycler Ⅱ实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性。 结果实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌的检测敏感度为1．0×10^2拷贝每反应体系;对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1．0×10^1 pg每反应体系;该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2h内完成。 结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力。     

白血病患儿巨细胞病毒感染的PCR与抗原检测方法比较

目的 对不同种类标本应用ＰＣＲ检测巨细胞病毒（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ,ＣＭＶ）ＤＮＡ,并与外周血白细胞ＣＭＶ抗体检测比较,以了解ＰＣＲ方法在诊断白血病患儿活动性ＣＭＶ感染时的意义。方法 实验组为３１例白血病患儿,对照组为３１例免疫功能正常儿童,两组儿童的年龄、性别无差异。应用ＰＣＲ方法检测血清、尿液和脑脊液ＣＭＶ ＤＮＡ,间接免疫荧光方法检测外周血白细胞ＣＭＶ抗原,ＥＬＩＳＡ方法检测血清抗