实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

荧光定量PCR监测单核细胞增多性李斯特菌研究

目的 探索一种快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌检验方法。方法 以单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因作为靶序列设计一对引物，并以标准单核细胞增多性李斯特菌菌株中提取的DNA作为模板，用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行监测与鉴定。结果 含有一段特征基因的600bp片段，具有良好的单核细胞增多性李斯特菌检测特异性。结论 荧光定量PCR比普通PCR具有特异性强、灵敏度高、重现性好。可以定量、快捷的应用于监测检验单核细胞增多性李斯特菌。     

荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病检测中的应用

目的:通过荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病菌检测中的应用,比较两种方法的敏感性、特异性、时限性、重复性。方法:2009年1月-2010年12月采集的样品进行常见食源性致病的细菌培养,随机抽取一部分样品进行荧光PCR检测。结果:细菌培养法在257份样品中检出单核细胞增生李斯特菌5株、金黄色葡萄球菌5株,检出率3.9%。所检出致病菌经荧光PCR法符合结果,符合率100%。随机抽取各类产品的20%共计49份样品进行沙门菌、大肠埃希菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌等核酸试剂盒检测。结果检出沙门菌1份、金黄色葡萄球菌2份、单核细胞增生李斯特菌1份、副溶血弧菌1份,其余致病菌核酸检测均未检出,检出率10%。结论:与传统的细菌培养法相比,荧光PCR法可提高食源性致病菌的检出率、缩短检出时间、适用于食源性致病菌的检测。     

两种方法检测单增李斯特菌的比较研究

[目的]探讨建立快速、准确的单增李斯特菌的检测方法。[方法]采用荧光定量PCR和传统细菌培养法,同时对单增李斯特菌进行检测,并对其敏感性与特异性进行比较。[结果]荧光定量PCR检测的敏感性可达19cfu／ml,敏感性高于细菌培养法,且特异性强,从细菌核酸提取至完成检测仅需3h。[结论]荧光定量PCR检测是快速敏感的方法,在应对突发公共卫生事件中能起到重要作用。     

应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线。24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

荧光定量PCR技术和分离培养法检测小肠结肠炎耶尔森菌的比较研究

目的比较荧光定量PCR法和分离培养法在检测小肠结肠炎耶尔森菌中特异性和灵敏度的差异。方法从686份婴幼儿腹泻患儿的粪便标本中提取细菌基因组DNA,在进行小肠结肠炎耶尔森菌保守基因fox A和黏附侵袭位点基因ail的实时荧光定量PCR检测的同时,也按常规方法进行菌株分离培养,并对2种方法的检出结果进行比较分析。结果686份标本中,分离培养法检测结果为阳性4份,阴性682份;荧光定量PCR法检测结果为阳性5份,阴性681份。荧光定量PCR法检出的5份阳性标本中,分离培养法结果为4份阳性,1份阴性。结论采用fox A联合ail基因的荧光定量PCR法特异性强,灵敏度高,且操作简便快速,检测成本低,对于监测小肠结肠炎耶尔森菌有重要意义。     

荧光免疫吸附法定量检测单核细胞增生李斯特菌

目的研制荧光免疫吸附法定量检测单核细胞增生李斯特菌。方法采用双抗夹心免疫吸附法筛选7株抗单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体,获得最佳配对抗体10E7H6和10A11。以生物素化的10A11为检测抗体,10E7H6为捕获抗体,建立了基于链霉亲和素标记荧光微球为检测探针的荧光免疫吸附法检测单核细胞增生李斯特菌。结果该方法中最佳捕获抗体浓度为10μg/mL,最佳检测抗体浓度为5μg/mL,反应最佳pH为7.4;在该条件下,单核细胞增生李斯特菌最低检测限为10~5 CFU/mL,比传统酶联免疫吸附法提高了两个数量级;与李斯特菌属内其他几种主要李斯特菌有一定的交叉反应,与其他非李斯特菌属的主要致病菌无显著交叉反应。结论该方法可用于纯培养液中单核细胞增生李斯特菌的检测,也可用于李斯特菌属内其他几种主要李斯特菌的免疫学快速筛查检测。     

牡蛎中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种无需前增菌快速检测牡蛎中单核细胞增生李斯特菌的PCR方法。方法 利用β-环糊精和膨润土包被活性炭处理牡蛎样品，去除聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)反应抑制因子，以单核细胞增生李斯特菌特异基因inlB为靶基因，建立无需样品前增菌的PCR快速检测方法。同时验证该方法的特异性、灵敏度及实用性参数，并评估该方法所用试剂在冷冻保存后的稳定性与实用性。结果 建立的PCR方法对130株目标菌和63株非目标菌的检测特异性为100%,灵敏度达10 CFU/25 g。该方法无需前增菌，4 h即可完成检测。PCR方法和国标方法对实际样品中单核细胞增生李斯特菌的检出率(均为13%)和活菌检测率(均为100%)一致，即符合率100%。此外，该方法所用试剂在-20℃冷冻条件下可稳定保存至少1年。结论 建立的PCR方法特异性强、灵敏度高，可快速、准确检测出牡蛎中的单核细胞增生李斯特菌。     

实时荧光定量PCR在食品致病菌检测中的应用

随着经济的全球化,食品安全已经越来越受到人们的关注,而微生物污染已成为食品安全的首要问题。食品致病菌是引发食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素。传统的检测方法必须经过细菌的分离、培养与鉴定,不但耗时耗力而且不适于大量样品同时检测,不能满足食物中毒和食源性疾病暴发时的检测需要。近年来随着P C R检测技术的快速发展,其在微生物检测中的应用也越来越广泛,实时荧光定量PCR作为PCR检测方法中的一种,因其具有较强的特异性和灵敏度并且还有检测速度快、准确性高等优点,在检测食品微生物的应用中有较强优势。本文介绍实时荧光定量PCR技术在金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌等几种常见食源性致病菌检测中的应用。     

Evaluation of effects of primary and secondary enrichment for the detection of Listeria monocytogenes by real-time PCR in retail ground chicken meat

A SYBR Green I based real-time PCR assay with inlA-specific oligonucleotide primers was developed for easy and rapid detection of Listeria monocytogenes in a model food that usually has a high incidence of contamination with this pathogen. Results with pure cultures and artificially contaminated chicken meat samples indicate that the PCR assay was highly specific and sensitive. The melting point analysis of the 160 bp amplified DNA fragment was different for L. monocytogenes isolates of the two major phylogenetic divisions of the species, 1 and 2. The assay was then used to survey retail ground chicken meat for contamination with L. monocytogenes. Thirty-seven samples were enriched according to the United States Department of Agriculture culture assays to detect L. monocytogenes on meat. The use and efficiency of PCR assay was examined following both primary and secondary enrichments, which were also plated on chromogenic agar for enumeration of L. monocytogenes and nonpathogenic Listeria spp. to investigate the discrepancies between culture and PCR. Overall, L. monocytogenes was detected in 75% of the samples. Primary enrichment yielded detection rates of 70% and 37% for culture and PCR, respectively. The corresponding rates for secondary enrichment were 54% and 70%, respectively. Test sensitivity is therefore influenced by the type of enrichment and is probably related not only to the limited growth of L. monocytogenes in the primary enrichment media (false-negative PCR results), but also to the high populations of nonpathogenic Listeria spp. in the secondary enrichment broths (false-negative culture results). The main challenge of rapid PCR-based detection of L. monocytogenes from food is the poor sensitivity of primary enrichment media. The improvement of enrichment conditions may help increase assay sensitivity.     

实时荧光PCR法检测正常人脑膜炎奈瑟菌

目的建立一种简易快速的实时荧光PCR方法（Q—PCR）并用于检测正常人群中脑膜炎奈瑟菌。方法采集成都市正常人群的咽拭子1008份，分别采用培养分离法和Q—PCR法检测Nm。绪果Q—PCR法方法的灵敏度、特异性分别为100％和100％，阴性预测值（NPV）为100．00％，阳性预测值13．09％，检出限为250du／ml体系，Q—PCR方法检出时间为3h，培养法阳性结果需时4d。Q—PCR技术检测1008份正常人群的咽拭子中NmDNA的阳性率为8．33％，培养法为1．09％。结论Q—PCR技术的灵敏度高于培养法，Q—PCR法具有灵敏、特异、经济、快速的特点，可用于疾病的快速诊断，特别适合正常人群的带菌率调查。     

香港海鸥形菌荧光PCR快速检测方法的建立

目的:建立检测香港海鸥形菌的实时荧光PCR方法。方法:根据香港海鸥形菌以16SrDNA基因设计探针和引物,建立检测香港海鸥形菌荧光PCR方法,并对建立的方法进行特异性、灵敏性的评价。结果:检测体系灵敏度高,菌液的最低检出限可达40 CFU/反应体系;特异性好,对329株细菌的检测符合率达100%。结论:建立的实时PCR检测方法可应用于食源性致病菌中香港海鸥形菌的快速检测。     

Taq Man-MGB探针Real-timePCR快速检测单增李斯特菌的研究

目的：建立TaqMan—MGB探针Real—time荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法：在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性TaqMan—MGB探针法引物及探针，通过Real—timePCR反应条件和反应体系的优化，实现对单增李斯特菌的快速检测；用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果：方法的灵敏性高，其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系，最低可检测57个拷贝数，经18h增菌，可检测低至4．5cfu／ml的细菌；特异性强，检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值（cT值）均小于25，而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值（CT值）大于35；快速，最快1h可出结果，实际样品20h可出结果，而常规细菌培养法需要一周以上；对103份速冻米面食品进行检测，13份阳性，与常规方法无显著性差异（P〉0．05）。结论：TaqMan—MGB探针的单增李斯特菌Real—time荧光PCR检测方法具有特异性强，敏感性高，易操作等优点，可推广应用。     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。     

食品中单增李斯特菌PCR检测方法建立与评价

目的建立单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特菌溶血素基因（hlyA），并评价该方法的特异性与敏感性。结果在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3．3ng／L的DNA。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便。为食品中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

河弧菌Taqman实时荧光PCR检测方法建立

目的 建立以Taqman实时PCR检测河弧菌的方法。方法 根据河弧菌toxR基因的保守序列设计引物和Taqman探针,建立检测河弧菌的实时PCR方法;对引物和探针的浓度进行优化,对优化后建立的方法分别进行实验室内的灵敏度和特异性评价,并与常规PCR比较。结果 建立了检测河弧菌的实时PCR方法,经优化该方法选择引物的浓度为100 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L;该方法对纯菌的检测下限为4.17×10²cfu/mL,比常规PCR高1000倍;针对toxR基因建立的河弧菌实时PCR方法,对8种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论 建立的方法能够特异和敏感地检测河弧菌,可用于河弧菌的快速筛检。     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立

目的建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法。方法用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌。结果通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线。单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系。结论该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查。