重组人类神经元14-3-3zeta信号蛋白的纯化及抗体制备

目的制备抗人脑14-3-3 zeta蛋白(31 ku)的多克隆抗体与单克隆抗体,为神经系统退行性疾病的诊断提供标志物.方法用纯化的rh14-3-3zeta蛋白免疫家兔,制备抗14-3-3多克隆抗血清;电洗脱、透析纯化rh 14-3-3/β-半乳糖苷酶融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rh 14-3-3 zeta单克隆抗体;测定所得抗体效价及其特异性反应.结果得到大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64;获得 1株能稳定分泌抗rh 14-3-3 zeta单抗的杂交瘤细胞株,其亚型为IgG1型,该株单抗可与重组14-3-3蛋白发生特异性反应.结论获得了敏感、特异的抗rh 14-3-3 zeta多克隆抗血清及稳定分泌抗rh 14-3-3 zeta单抗的杂交瘤细胞株,为神经系统退行性疾病提供诊断标记.     

El-Tor生物型霍乱弧菌可溶性血凝素的纯化

用改进的Finkelstein的方法从Wg2(El-Tor 生物型)弧菌菌株中提纯的可溶性血凝素有下列特点:(1)纯化的血凝素(SHA)具有凝集红细胞的作用,且对不同来源的红细胞的敏感性不同。(2)纯化的SHA具有蛋白酶的水解活性。(3)经免疫双扩散、免疫电泳检测,纯化的SHA,粗制SHA与纯SHA抗血清反应均呈单一沉淀线。与霍乱肠毒素无反应。(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-凝胶电泳的结果与文献报道基本一致。     

一种简易制备白蛋白纯品及抗血清的方法——凝胶切割制备法

利用凝胶切割纯化法得到免疫纯人血清白蛋白（ＡＬＢ），经聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＣ）电泳确认为单一带，经ＳＤＳ－ＰＡＣＥ确定其相对分子质量为６７４６２．８０Ｕ，与Ｓｉｇｍａ纯品ＡＬＢ及日本产羊抗人ＡＬＢ抗血清免疫双扩散融合试验验证其为纯品ＡＬＢ。利用得到的ＡＬＢ免疫绵羊制备羊抗人白蛋白抗血清与日本产品比较，为单价特异性抗血清。     

人血清补体Cl_r亚基的分离

人血清中补体第1成分业基的分离及抗血清的制备曾于前文报道,作者在分离了人Cl_s扩亚基制备了抗人Cl_s抗血清的基础上,设计了一个较简便的分离Cl_r亚基的方法,将抗人Cl_s抗血清经DEAE-纤维素层析纯化后,偶联到过碘酸活化的不溶性载体SephadexG-75上,制备成抗Cl_s免疫吸附剂,在Ca~(2 )存在下吸附人血清中的Cl_(rs)成分,再用EDTA螯合掉Ca~(2 ),使Cl_r解离下来,从而获得了电泳纯的活性Cl_r亚基成分。     

HBsAg和抗-HBsIgG的分离纯化及其ELISA药盒的研制

HBsAg阳性血清经PEG分级、DEAE DE22离子交换柱层析、羊抗-NHS固相柱和抗-HBs IgG固相柱纯化,得高活性的HBsAg(CEP≥1∶128,(280mm)/(260mm)=1.15);而高活性的抗-HBs(ID=1∶1024,(280mm)/(260mm)=1.29)必须用高滴度的抗血清,经硫酸铵分级、NHS固相柱和HBsAg固相柱分离,它们是制备敏感性高、特异性强的ELISA药盒的关键,同时药盒还与包被抗体和指示抗体如何合理搭配相关,如指示抗体为山羊抗-HBs,则包被抗体最好是豚抗-HBs.搭配效应的发现将有利于提高ELISA检测水平和药盒的经济效益.     

ARMET的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的 制备抗人ARMET(arginine-rich,mutated in early stage of tumors)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 将pET28a-ARMET转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,用预装好的Ni-beads柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳及考玛斯亮蓝染色方法 判断融合蛋白的表达量及纯度.将纯化的ARMET免疫雌性BALB/c小鼠后采用淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌抗ARMET杂交瘤细胞株.体内诱生腹水法制备mAb,间接ELISA法测定其效价及抗体亚型,辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb.用免疫荧光双标及Western blot法对抗体的特异性进行了鉴定.结果获得了纯度较高、浓度较高的融合蛋白;建立了7株稳定分泌特异性抗ARMET mAb的杂交瘤细胞株,诱生腹水法获得的抗体效价在1×10-5～1×10-7之间.且均有较好的特异性.结论 已成功制备出抗ARMET mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究奠定了基础.     

一种简易制备白蛋白纯品及抗血清的方法──凝胶切割制备法

利用凝胶切割纯化法得到免疫纯人血清白蛋白（ＡＬＢ），经聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＣ）电泳确认为单一带，经ＳＤＳ－ＰＡＣＥ确定其相对分子质量为６７４６２．８０Ｕ，与Ｓｉｇｍａ纯品ＡＬＢ及日本产羊抗人ＡＬＢ抗血清免疫双扩散融合试验验证其为纯品ＡＬＢ。利用得到的ＡＬＢ免疫绵羊制备羊抗人白蛋白抗血清，与日本产品比较，为单价特异性抗血清。     

天花粉蛋白新有效组分的纯化及相对分子质量测定

目的：研究从新鲜栝楼块根中分离纯化天花粉蛋白新有效组分的方法,测定新有效组分的相对分子质量,并对野生型及人工培植型植物来源的新有效组分进行对比研究。方法：采用粉碎、盐析、透析和离子交换层析、分子筛层析方法分别从野生型及人工培植型新鲜栝楼块根中分离纯化天花粉蛋白新有效组分,应用LDI-1700激光解吸电离飞行时间质谱仪测定其相对分子质量。结果：从野生型新鲜栝楼块根中纯化的天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量为33 388.9,产率为1.2 mg•g^-1;从人工培植型新鲜栝楼块根中纯化的天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量为32 116,产率为0.3 mg•g^-1。两者的相对分子质量高于已应用于临床的天花粉蛋白针剂（相对分子质量为26 000）及从美国产的栝楼中分离纯化出的TAP29（相对分子质量为29 000）,野生型产率高于人工培植型的产率。结论：分别从野生型与人工培植型新鲜栝楼块根中纯化的天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量及含量不同,且两者的相对分子质量亦不同于天花粉蛋白针剂及TAP29。     

彩虹明樱蛤酸性多糖的提取与纯化

目的:优化彩虹明樱蛤酸性多糖的制备工艺.方法:采用碱提醇沉法,运用正交试验对彩虹明樱蛤多糖的分离过程进行优化,包括时间、温度、pH值和乙醇浓度4个因素;所获多糖经去蛋白、去色素、去离子后,用DEAE-纤维素离子交换柱纯化,以Sephadex G-100和醋酸纤维薄膜电泳鉴定及红外光谱初步研究.结果:优化的多糖提取制备工艺为:时间6h、温度70℃、pH8.0、乙醇浓度70％,获得纯白略带暗褐色的颗粒状固体;DEAE-纤维素离子交换柱分离洗脱后得到靶多糖组分彩虹明樱蛤酸性多糖(Moerella iridescens acidic polysaccharide,MIAP),经Sephadex G-100和醋酸纤维薄膜电泳鉴定,MIAP为均一多糖组分,呈乳白色绵柔絮状;红外光谱扫描,MIAP含α-D型吡喃葡萄糖.结论:正交试验法优化了MIP的提取工艺,分离纯化了MIAP.     

人肝癌组织特异性γ-谷氨酰转移酶分离纯化

目的:分离纯化人肝癌组织中特异性γ-谷氨酰转移酶(GGT),为进一步制备其抗血清提供抗原材料,以便对肝癌早期诊断进行研究。方法:人肝癌组织经匀浆、离心、溶解、透析、凝胶层析及凝集素亲和层析等步骤进行分离纯化;纯化过程用IFCC推荐方法监测GGT催化活性,紫外法监测蛋白质出峰图谱,Lowry法测定蛋白含量。结果:经过粗提、DEAE阴离子交换层析、凝胶过滤层析及凝集素亲和层析等纯化步骤得到电泳纯的GGT,其比活为10.58U/mg蛋白,纯化倍数为84.9,得率为1.60%。结论:该方法能够较好地分离纯化人肝癌组织中特异性GGT。     

抗人精子外套抗原单抗的纯化及相应抗原的提纯和鉴定

目的：研究人类精浆中一类特异性的抗原成份（精子外套抗原sperm－coatingantigens，SCA）。方法：本实验用已制备得的一株抗人精浆来源的精子外套抗原单克隆杂交瘤细胞株D1．在小鼠腹腔增殖生产大量腹水单克隆抗体，通过快速蛋白液相层析仪（FPLC）系统的羟基磷灰石柱，一次性从小鼠腹水中纯化此抗体，并制备免疫亲和层析柱，从精浆中分离到相应的抗原成份。结果：经鉴定该抗原成份分子量为20kD，来源于精囊腺，具有器官特异性。结论：该SCA的提纯，为抗精子避孕疫苗的研制提供了基础实验材料，并且有助于进一步研究其在生殖活动和免疫不孕病因中的作用。     

木豆中牡荆甙与异牡荆甙的分离与鉴定

为进一步了解木豆（ＣａｊａｎｕｓｃａｊａｎＬ．Ｍｉｌｓｐ）嫩茎叶的化学成分,以溶剂法、结晶法及柱层析法从木豆中将牡荆甙（ｖｉｔｅｘｉｎ）与其异构体异牡荆甙（ｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ）分离,并以红外光谱法（ＩＲ）、紫外光谱法（ＵＶ）、质谱法（Ｍｓ）、１３Ｃ谱法（１３ＣＮＭＲ）、１Ｈ谱法（１ＨＮＭＲ）确定了两者的结构,其中异牡荆甙系首次从木豆中分得。     

牛肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1的分离纯化及其在抗肾小球基底膜相关疾病中的应用

目的:分离纯化抗肾小球基底膜(GBM)抗体的特异性靶抗原,并评价其在抗GBM抗体检测中的应用价值.方法:通过孔径不同的筛网从牛肾脏中提取牛肾小球,采用改良的40 g*L-1去氧胆酸钠破坏肾小球细胞而获得GBM,经胶原酶消化后收集可溶性牛GBM粗抗原.在pH 7.5的条件下经Mono Q阴离子交换层析柱分离纯化肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1[α(Ⅳ)NC1],并经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定其纯度及活性.应用2 mg*L-1纯化的牛α(Ⅳ)NC1包被酶标板,建立牛α(Ⅳ)NC1-ELISA 方法检测血清中抗GBM抗体,并与经典的以人GBM可溶性蛋白为粗抗原的ELISA法进行对照研究.血清来自90例已知抗人GBM抗体阳性的患者、100例正常人和50例其他肾脏疾病患者.对两种方法进行相关分析并计算牛α(Ⅳ)NC1-ELISA的敏感性、特异性.结果:纯化的牛α(Ⅳ)NC1经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为相对分子质量为25×103和50×103的蛋白并可被抗GBM抗体阳性血清所识别;应用牛α(Ⅳ)NC1-ELISA法检测抗GBM抗体的敏感性和特异性分别为100%和98%,与人GBM粗抗原-ELISA的相关性为0.6.结论:应用改良的去氧胆酸钠方法破坏肾小球内细胞并进一步经MonoQ离子交换柱分离纯化牛α(Ⅳ)NC1,可以得到高纯度的特异性靶抗原;纯化的牛α(Ⅳ)NC1可以作为特异性抗原来检测人抗GBM抗体.     

抗人红细胞血型糖蛋白A非凝集性单克隆抗体的研制及其生物？…

目的 研究优质的抗人红细胞血型糖蛋白Ａ单克隆抗体（ＭＣＡＢ－ＧＰＡ）因为该抗体是研制快速全血凝集试剂中双功能抗体的关键成份,为在我国研制能诊断多种疾病的快速全血系列诊断试剂创造条件,方法 首先用ＭＮ亚型ＧＰＡ（购于美国Ｓｉｇｍａ公司）免疫小鼠,采用常规杂交瘤细胞技术进行融合和克隆,用ＥＩＡ和血凝方法进行生物特性鉴定,结果 建立１２个ＭＣＡＢ－ＧＰＡ株,１２个抗体株与ＧＰＡ发生特异性反应。但对Ａ,Ｂ     

大白鼠海马CA_1区锥体细胞的急性分离及其电生理学特性

目的：建立适用于膜片组技术（Patchclamptechnigue，PCT）的大白鼠海马CA_4区锥体细胞（rathippocampalCApyramidalneuron，RHCPN）的急性分离方法，并测定该细胞的电生理学特性。方法：用7～21d大鼠，以链霉蛋白酶E酶解加吸管吹打法制备RHCPN，用全细胞PCT测定其电生理学特性。结果：分离的RHCPN易用于PCT，且具有正常的电生理学特性，并保存了主要的电压依赖性和受体门控性高于通道特性。结论：本法分离的RHCPN适用于PCT电生理学研究。     

腹水中乙型、丙型及庚型肝炎病毒的联合检测

观察小剂量血脂康、普伐他汀对高血脂病人的长期调脂作用。方法：多中心,１９５例高血脂病人,分血脂康组［每晚睡前口服血脂康２粒（含他汀类物质６ｍｇ）］与普伐他汀组（每晚睡前口服５ｍｇ）治疗６个月,比较治疗前、后血脂水平变化及两组间差异,用方差分析法检验及ｘ２检验。结果：血脂康与普伐他汀治疗６个月时,ＴＣ下降１６％及１７％,ＴＧ下降１３％及１５％,ＬＤＬ下降２３％及２１％;ＨＤＬ在血脂康组上升２％,在普伐他汀组上升１０ ％。两组均能有效降低 ＬＤＬ／ＨＤＬ。两组间比较普伐他汀升 ＨＤＬ作用较血脂康稍好（ Ｐ＝ ０．０５）。两组 ＴＣ、ＬＤＬ、ＬＤＬ／ＨＤＬ下降均有统计学意义。两组 ＴＧ下降及 ＨＤＬ升高无统计学意义,血脂康及普伐他汀组降 ＴＣ疗效分别为 ５４． ６％、 ６８． ４％;升 ＨＤＬ疗效分别为 ４９．１％、５３． ９ ％;降 ＴＧ为 ４６．２ ％、４０． ８ ％。两组疗效差异均无显著性。两组均未见严重副作用。结论：小剂量他汀类药物（如血脂康和普伐他汀）长期口服治疗成人血脂紊乱安全、有效。     

合欢皮中一个新的八糖苷

目的:研究中药合欢皮化学和活性成分.方法:用溶剂、色谱和谱学方法分离和鉴定化合物.结果:从合欢皮95%(体积分数)乙醇提取物中分得一个八糖苷(1),经化学与谱学分析方法鉴定其结构为3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]-21-O{(6S)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-O-[3-O-(6S)-2-反式-2-羟甲基-6-甲基-6-羟基-2,7-辛二烯酸基)-β-D-吡喃木糖基]-2,7-辛二烯酸基}-金合欢酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基酯.结论:1为新皂苷,命名为合欢皂苷J24 (Julibroside J24).     

复方氯唑沙宗片中氯唑沙宗与对乙酰氨基酚含量测定

目的 研究复方氯唑沙宗片剂中氯唑沙宗和对乙酰氨基酚的含量测定方法。方法 采用双波长倍增差示法。结果 氯唑沙宗和对乙酰氨基酚的平均回收率与相对标准偏差分别为９９．５％、０．８２％、１００．６％,０．６６％（ｎ＝５）。结论 本法不经分离可同时测定两组分的含量。     

Alloferon-1抗生肽串联重组表达及重组Alloferon-1体外抗肿瘤活性

目的:构建含胰蛋白酶酶切位点的Alloferon-1抗生肽重复串联DNA片段及其原核表达系统,了解有赖氨酸尾重组Alloferon-1( rAlloferon-1)体外抗肿瘤活性.方法:根据Alloferon-1序列不合精氨酸和赖氨酸的特点,构建C端加有含胰蛋白酶酶切位点赖氨酸的14 x Alloferon-1抗生肽重复串联DNA片段.采用pET42a 表达载体和E.coli BL21 DE3表达宿主菌,构建Alloferon-1重复串联DNA片段原核表达系统.SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组产物表达量,Ni-NTA亲和层析、胰蛋白酶酶切和Sephadex G-50层析法提纯14×rAlloferon-1-K及其rAlloferon-1 -K单体.BALB/c小鼠脾细胞分别与K562、KB和SGC肿瘤细胞共培养模,采用CCK-8法检测rAlloferon-1 -K、化学合成Alloferon-1( cAlloferon-1)及Alloferon-1 -K( cAlloferon-1 -K)体外抑制肿瘤细胞生长及增殖的活性并进行比较.结果:原核表达系统E.coli BL21 DE3pET142a-14 x Alloferon-l-K在IPTG诱导下能有效表达14×rAlloferon-1-K蛋白,其产量约为细菌总蛋白的30%.0.1～10 ng/ml 的rAlloferon-1-K具有明显提高小鼠脾细胞抑制K562、KB和SGC肿瘤细胞的生长及增殖(P＜0.01),rAlloferon-1 -K的抗肿瘤活性与cAlloferon-1及cAlloferon-1 -K比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:本研究成功构建了Alloferon-1抗生肽重复串联原核表达系统,有效地提高了Alloferon-1产量;而且rAlloferon-1 -K仍保持原有的体外抗肿瘤活性.