登革1型病毒的单克隆抗体

我们用SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用登革1型病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞在融合剂PEG-1000的诱导下进行融合,获得了15株产生抗登革1型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中14株属登革病毒型特异,1株属登革病毒亚群特异,它们的荧光效价均在10,240以上。15株杂交瘤均无血凝活性,3株有补体结合活性。1D_4,1B_9的IgG亚类为IgG_1,1F_(11)为IgG_2a,轻链均为K型。1株杂交瘤(1D_4)的染色体数为87～115。用SDS-PAGE测定1D_4分子量,重链为54,000,轻链为24,000。15株杂交瘤连续传代3～6个月,冻存复苏后抗体水平未见下降。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

我国两株登革2型病毒分离株结构蛋白C，PrM（M），E和非结构蛋白NS1基因变化的研究

对我国两株登革２型病毒分离株的结构蛋白Ｃ，ＰｒＭ（Ｍ），Ｅ和非结构公白ＮＳ１基目的核苷酸及相应的氯基酸序列进行分析，并与国外登革２型毒株的核苷酸序列同源性、碱基组成、糖基化位点、半胱氨酸残基、蛋白裂解位点和疏水剖面图等进行了比较分析。结果发现Ｄ２－４３和Ｄ２－０４株Ｃ—ＮＳ１基因的读码柜架基本相同，均由３３８１个核苷酸组成，编码氧基酸总为为１１２７，糖基化位点和保守的半胱氯酸残基的数目和位置均相同，但也发现两株之间存在一定的差异，它们的核苷酸序列同源性只有９３名％，氨基酸列的类似性为９１．３％。进一步对两个毒株各个蛋白的基囚分别进行比较，发现Ｃ和Ｅ基因同源性为９５％—９７％，ＮＳ１基因同源性为９２．２％，唯有ＰｒＭ（Ｍ）基目差异较大，同源性只有８６．７％。两株之间的主要差别在于ＰｒＭ（Ｍ）基目的变化。当与国外其他登革２型毒株比较时，发现存在两个可变序列，其中１５１—２９４位恰好是ＰｒＭ（Ｍ）区，与两株之间比较的结果一致。     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２ ４３） 感染的Ｃ６／３６ 细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ 为模板,进行Ｄ２ ４３ 株ＮＳ３ 基因ｃＤＮＡ 片段的反转录 ＰＣＲ 扩增,片段长度为１１７６ ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ 片段克隆到Ｔ 载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓⅡ（ ＋ ） 中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

登革2型病毒株抗原分析

本文试用标记分析法研究我国海南地区3年来(1985～1987)流行的登革2(DEN-2)型病毒株抗原的变化.用3种单克隆抗体(黄病毒属特异、亚属特异及DEN-2型型特异)分析了8个DEN-2型流行株并与标准新几内亚B株进行了比较.发现5株与标准株类似,3株显示出明显差异.标记分析法为病毒抗原分析提供了一个简便快速的方法,并且可用来监测一个地区病毒株群的变化及新株的引入.     

我国登革3型病毒广西株基因组非编码区结构特征的研究

应用cDNA末端快速扩增法（RACE）,获得我国登革3型病毒株基因缓 的包括5‘和3‘端非编码区的扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳观察其长度分别为710bp和470bp。序列分析表明,与登革3型病毒菲律宾株（H87株）核苷酸序列同源性＞99％。进化树分析提示,该株病毒属于登革3型病毒Ⅰ亚型。基因组的5‘和3‘端有含有较强的二级结构域。     

我国登革2型病毒04株包膜蛋白基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列

本文报告我国登革2型04株包膜蛋白基因的核苷酸及氨基酸序列,并与登革1、3、4型及其它2型毒株如几内亚C株(NGC)、牙买加株1409(JAM)、候选疫苗株S1以及马来西亚当地流行株M1(登革出血热)、M2(登革休克综合征)。 M3(登革热)进行比较。结果表明D_2-04株E蛋白基因的核苷酸序列与NGC,JAM和S1的同源性分别为95.0％、97.4％和90.0％;与M1、M2、M3的同源性分别为93.3％、92.1％和94.3％;与其它登革血清型的同源性大约为65％。登革2型04株蛋白的氨基酸序列与NGC、JAM、S1、M1、M2、M3的类似性分别为96.8％、97.2％、91.4％、95％、95.6％和94.3％。与其它登革血清型氨基酸类似性大约为62％～68％;与其它黄病毒的类似性范围为43％～47％。推断的氨基酸序列显示出7个保守的半胱氨酸残基及两个潜在的糖基化位点,分别位于Asn-67和Asn-153位。     

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用     

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的：构建我国登革２型病毒４３株ｐｒＭ－Ｅ基因的甲病毒（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ,ＳＦＶ）重组ＲＮＡ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法：首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入ｐＳＦＶ载体的多克隆位点,再把ｐｒＭ－Ｅ基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒ＤＮＡ经体外转录后,通过电穿孔法将其转录的ＲＮＡ产物导入宿主细胞,并采用间接免疫荧光法检测ｐｒＭ－Ｅ基因的表达。结果：已获得含多种酶位点的ｐＳＦＶ病毒载体,并且所构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ,在宿主细胞中的表达产物可与登革２型病毒特异抗体起反应。结论：构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ可表达我国登革２型病毒株的特异蛋白。     

双标记基因质粒（pSVneo—gpt）DNA的重组

利用基因转移技术,将受到损伤的重组DNA分子导入哺乳动物细胞中,观察受损的外源DNA分子在细胞中的修复和表达情况,是研究细胞DNA损伤修复过程的一种新的实验手段。实验室通常用的重组DNA分子只带有单个选择标记基因,当用于上述实验时,尤其是要比较不同细胞的DNA修复效率,因受到基因转移效率、未被修复或错误修复的受损标记基因不能正确表达等因素的影响,使实验结果出现一定的误差。本试验将选择标记基因gpt和neo重组到一个质粒DNA分子中,这样在以后的研究中,可以用限制性内切酶等损伤其中一个标记基因,再将质粒     

登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的：研究含登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK－21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3．1的KpnⅠ位点和EcolRⅠ位点之间,获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK－21细胞,G418选择培养。挑取单细胞克隆,RT－PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达,结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中,有4个克隆的RT－PCR鉴定为阳性,蛋白质印迹结果表明NS1基因获表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK－21细胞中有稳定表达,因此含NS1基因的该重质粒DNA可作作核酸免疫。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸,序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达,表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应,且表达蛋白主要位于细胞浆中。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

登革病毒DNA疫苗的研究进展

目前登革病毒（ dengue virus ）感染已成为全球严重的公共卫生问题,亟待有效的疫苗进行特异性预防。与减毒活疫苗、灭活疫苗等传统疫苗相比,DNA疫苗具有制备简便、价格低廉、无感染风险、便于储运以及长效性好等特点,成为近年来登革病毒疫苗研究的热点。该文综述了登革病毒DNA疫苗构建策略、接种方式、免疫策略、免疫佐剂、免疫效果等方面的研究进展。     

pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建

目的 构建pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒,并进行鉴定。方法提取Wistar乳鼠大脑组织总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增UCH-L1基因,定向克隆至载体pEGFP-N1,构建重组质粒,经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了UCH-L1基因重组质粒,可用于神经细胞转染,进行后续研究。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。