布氏田鼠鼠疫菌102 kb pgm基因座结构研究

目的　研究布氏田鼠鼠疫菌株 1 0 2kbpgm基因座结构与其他类型鼠疫菌是否有区别 ,及其与布氏田鼠鼠疫菌株的独特特征的关系。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)的方法 ,共设计 2 5对嵌套的引物 ,以喜玛拉雅旱獭鼠疫菌株和布氏田鼠鼠疫菌株的染色体DNA为模板 ,分段扩增该区域内的DNA ,选择差异较大的扩增片段进行克隆和测序 ,与已发表的序列比较。结果　布氏田鼠鼠疫菌株的 1 0 2kbpgm基因座一端缺失了1 952个碱基 ,即插入序列IS1 0 0。另外 ,在测序的这段基因中 ,一类似于可变数量串联重复序列 (VNTR)的区域 ,布氏田鼠鼠疫菌比已发表的序列多出几个拷贝。结论　布氏田鼠鼠疫菌株的 1 0 2kbpgm基因座序列改变了 ,一端缺失了插入序列IS1 0 0 ,这就使得它的毒力岛不容易丢失 ,保持了 pgm+表现型的稳定 ;与其毒力的关系 ,有待于进一步研究     

我国鼠疫耶尔森菌Pgm特征的研究

目的　对从我国不同类型疫源地分离的鼠疫菌进行色素沉着因子 (Pgm )表型的分析。方法　用氯化血红素培养基或刚果红培养基培养鼠疫菌 ,对不同颜色的菌落进行计数 ,计算鼠疫菌Pgm的阳性率。 结果　我国 10个疫源地的 16个生态型和新发现的四川青海田鼠型 ,除昆仑山A、B型外 ,其他各型的菌株均含有Pgm+ 菌 ,以青海田鼠型、锡林郭勒高原型、北天山东段型、北天山西段A型、北天山西段B型菌株的Pgm+ 率为高 ,Pgm+ 菌株 >90 %。结论　青海田鼠型、锡林郭勒高原型、北天山东段型、北天山西段A型、北天山西段B型菌株的Pgm+ 表型稳定。     

河北省鼠疫耶尔森菌多位点串联重复序列分析

目的对分离自河北省长爪沙鼠鼠疫疫源地的116株鼠疫菌株进行基因分析研究。方法根据鼠疫基因组比对,选择15对引物对测试菌株进行PCR扩增,并对扩增结果进行分析。结果 15对引物对116株实验菌株均得到相应的扩增结果,同一引物测试菌株扩增结果目标条带长度均一致,串联重复序列的重复数相同。不同引物扩增目标条带长度不同,串联重复序列的重复数也不同,如引物M52对所有菌株扩增产物长度均为153 bp,串联重复序列的重复数均为3,而引物M59的扩增产物长度为250 bp,重复数均为7。结论多位点串联重复序列分析(MLVA)证实河北省鼠疫自然疫源地的鼠疫菌基因稳定,鼠疫菌MLVA数据库将对未来的鼠疫菌变异和溯源提供技术支持。     

四川省巴塘县首次分离鼠疫菌的遗传学特征

目的 了解分离自四川省巴塘县的首株鼠疫菌的生态型和分子生物学特征,为因地制宜制定鼠疫防制策略提供科学依据.方法 将传统的鼠疫菌生化表型鉴定方法和多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的分型方法相结合,确定巴塘县鼠疫菌株的型别,并进行溯源分析.结果 四川省巴塘县鼠疫菌株能够酵解甘油、阿拉伯糖和麦芽糖,且具有硝酸盐还原能力,但不能酵解鼠李糖,符合青藏高原生态型鼠疫菌的表型特征;MLVA型别与分离自青海省和西藏自治区的青藏高原生态型鼠疫菌相同.结论 四川省巴塘县鼠疫菌的生态型为青藏高原型,与该菌株亲缘关系最近的鼠疫菌在青海省和西藏自治区均有分布.巴塘县是一个新发现的青藏高原喜马拉雅旱獭型鼠疫自然疫源地.     

利用M28串联重复序列对鼠疫菌进行基因分型

目的利用串联重复序列对我国的鼠疫菌株进行基因分型。方法对我国的165株鼠疫菌株的染色体DNA进行PCR扩增，然后利用UVlpro GAS7001X凝胶影像分析系统对扩增图谐进行长度分析。结果实验菌株都可以扩增出目的条带，按照其扩增片段长度分析可将实验菌株分为12个菌犁。结论利用串联重复序列的长度多态性对我国的鼠疫菌株进行基因分型是一种切实可行的方法。     

肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型

目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA,建立和优化随机扩增多态性DNA（RAPD）反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增,筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用,每一菌株均可扩增出4~10条DNA片段,大多数片段在100~2000bp之间,共扩增出42条RAPD条带,其中共有条带7条,多态性条带35条,多态性为83.3%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在42.6%~100%之间,在0.850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势,对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。     

随机扩增多态性DNA技术用于鼠疫耶尔森氏菌基因分型的研究

目的 对来自全国不同疫源地、不同生态型的１０３株鼠疫耶尔森氏菌进行基因分型研究。方法 用随机扩增多态性ＤＮＡ技术（ＲＡＰＤ）。结果 将鼠疫耶尔森氏菌分成两种基因型别：全国大部分菌株为ＲＡＰＤ－１型,青海省境内的大部分菌株为ＲＡＰＤ－２型。结论 不同生态型的鼠疫耶尔森氏菌基因结构存在差异,为鼠疫耶尔森氏菌的基础研究和防治提供依据。     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

2017年河北长爪沙鼠疫源地鼠疫菌的生态及差异区段分型研究

目的研究2017年河北康保长爪沙鼠疫源地鼠疫耶尔森菌的生态及差异片段(DFR)分型,探讨其流行特征。方法分离培养鼠疫菌,进行糖醇酵解实验以确定生态型;煮沸法提取鼠疫菌DNA,进行23对DFR和PMT1质粒序列PCR扩增,并进行PCR产物电泳分析。结果 3株菌(201701、201702和201703)均发酵甘油,阿胶糖产酸不产气;不发酵麦芽糖,鼠李糖;201701,201702两株菌迟缓发酵蜜二糖,201703不发酵蜜二糖;脱氮均为阴性。201701、201702、201703菌株均缺失DFR位点1、6、7、12、13、15、16、17、18、23。结论 2017年河北省鼠疫菌株生态型为B群鄂尔多斯高原型,差异片段分型为G20型。     

随机扩增多态性DNA技术用于青藏高原型鼠疫菌的比较

目的对青海、西藏和甘肃省（自治区）境内不同宿主体内分离的21株青藏高原型鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的基因进行分析,旨在比较不同宿主鼠疫菌之间的关系。方法采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术。结果扩增产物在凝胶电泳上显示的条带,其中16007、28001、01080号菌株相同,且与其余18株菌株存在差别。结论该实验中不同宿主体内检出的21株青藏高原型鼠疫菌在遗传学上属于同源。     

中国鼠疫耶尔森菌的分子生物学特征与遗传学意义

目的 根据中国鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的分子生物学特征分析其遗传背景。方法利用实验研究中rRNA基因指纹图(ribotyping)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机扩增DNA多态性(RAPD)及插入序列(IS)等方面工作的原始数据,通过聚类分析等统计学手段,探究中国鼠疫菌株间的遗传学距离,分析各种方法作为鼠疫菌分子识别特征的意义。结果 rRNA基因指纹图型与脉冲场电泳型之间是相对应的,但同属于7拷贝rRNA基因的田鼠菌株与西藏仲巴菌株,其间的遗传学距离,却较6拷贝rRNA基因的菌株还远。而随机扩增型与rRNA基因型之间对应关系较不明确,有较多的例外情况。用相似值可以表示这些菌株之间的遗传距离。结论 中国的鼠疫菌具有多种独特的分子生物学特征,其中新疆灰旱獭疫源地和西藏南部冈底斯山地理环境复杂,有较多的自然屏障,使鼠疫菌在流行过程中,限于局部地区,各自独立进化,产生了相互混合存在的多种基因类型。     

利用插入序列IS285对云南玉龙鼠疫耶尔森菌进行初步分析

目的了解新发现的玉龙鼠疫菌的遗传特征，分析其与中国各型鼠疫菌的亲缘天系。方法根据鼠疫菌C092株基因组DNA中的6个IS285位点设计引物，利用聚合酶链反应（PCR）对五龙鼠疫菌及我国其他各型鼠疫菌进行分析，通过SPSS软件对结果进行聚类。结果与CO92相比，我国鼠疫菌的某些IS285位点存在变异。5株玉龙鼠疫菌中有4株结果一致，另1株的一个位点发生变异。通过6个位点的PCR，可以将我国鼠疫菌聚为8类。所研究的5株玉龙鼠疫菌分别属于2种聚类，其中4株与滇西纵谷型、滇闽居民型及大部分灰旱獭菌株、全部喜马拉雅旱獭菌株聚为一类。结论对玉龙鼠疫菌的遗传特征获得初步了解，提示玉龙菌株在我国鼠疫菌传播演化过程中可能具有较重要地位．     

鼠疫耶尔森氏菌IS 1541的研究

目的：研究鼠疫耶尔森氏菌的插入序列ＩＳ １５４１的插入位点的特性。方法：用一条锚定的ＩＳ １５４１内部锚定引物和一条随机引物进行ＰＣＲ扩增;核酸分子杂交技术;克隆;测序。结果：１４株鼠疫菌的扩增普谱基本相同,杂交图谱差异,可分成３种类型。克隆、测序其中一个片段,其序列仅在两端的引物区与ＩＳ １５４１同源,而与Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ １６５５的ｐｒｌｃ基因同源性较高。结论：ＩＳ １５４１在鼠疫     

中国鼠疫菌某些生化特征及流行病学意义

目的 探讨中国鼠疫菌株生化表征的遗传变异与分型地位。方法 采用平皿单菌落法，实验观察我国17个生态型共336株鼠疫菌酵解麦芽糖、鼠李糖、阿胶糖、甘油及脱氮反应的变化。结果 发现松辽平原、滇闽居民区和滇西纵谷区3个生态型部分菌株对甘油、阿胶糖、麦芽糖酵解有变异，可同时出现酵解和不酵解的单菌落，而且特性较稳定；其余14个生态型鼠疫菌单菌落酵解能力与过去资料报道一致无明显变化；根据实验结果可将中国鼠疫菌分为12个生化型。结论 我国鼠疫菌对糖酵解特性稳定，具有一定的分型意义，滇闽居民区与滇西纵谷区生态型鼠疫菌株可能源于一个祖先。     

复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断。结果该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101~1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102cfu/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均<5%。结论本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义。     

鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立

目的:将环介导等温扩增技术(LAMP)应用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。方法:针对鼠疫耶尔森氏菌F1基因设计特异性引物,进行LAMP扩增。应用LAMP技术对鼠疫菌和非鼠疫菌进行检测以确定其特异性;对倍比稀释鼠疫菌液进行检测以确定其灵敏度,并与常规PCR方法进行比较。结果:对10种非鼠疫菌进行LAMP扩增,均为阴性结果,证明该方法具有很高的特异性。LAMP方法最低检出量为20个鼠疫菌,比常规PCR方法的灵敏度高10倍。通过加入染料进行LAMP扩增可直接观察结果。结论:本方法检测鼠疫耶尔森氏菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、结果易于判定,有望发展成为快速检测鼠疫耶尔森氏菌的有效手段。     

青藏高原鼠疫耶尔森菌基因型分布

目的研究青藏高原鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）基因组型分布特征.方法对分离到的青藏高原鼠疫菌297株,根据已经证实的22个差异区段设计引物,每株鼠疫菌的每个基因差异区段都采用PCR技术进行验证.结果在喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地中,鼠疫菌基因组型有9种,分别为1、5、6、7、8、10、11、新基因组型和Ype-ancestor型,其中以5、8和10型为主,3种基因组型合计所占比例为80.6%（204/253）,而且不同地区鼠疫菌基因组型的分布也不一致.青藏高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因组型全部为14型.结论青藏高原鼠疫菌基因组型分布具有明显的地理特征.根据基因组型的分布状况推测出了鼠疫菌在青藏高原的传播路径.     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.