角膜缘干细胞克隆化培养影响因素的研究

目的探讨丝裂霉素C处理Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件,了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。设计对照实验研究。研究对象兔角膜缘干细胞单纯培养组,兔角膜缘干细胞与Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。方法采用DMEM/F12培养基进行细胞培养,观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞,与饲细胞混合接种,观察干细胞克隆形成情况,比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞,间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原(PCNA)情况。主要指标细胞数/毫升,细胞克隆形成率。结果4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss3T3细胞,培养期间(约12日)细胞数量无明显变化,可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团,细胞的平均CFE比较:有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组(t=2.982,P<0.01)。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较,有饲细胞组明显高于无饲细胞组(t=3.007,P<0.01)。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。结论角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆,其中含有干细胞,且具有高增殖力。     

培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

人骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞缺损动物模型中的分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化为角膜上皮细胞的可塑性及可行性。方法20只日本大耳白兔随机分为对照组和实验组,每组10只,右眼为实验眼。实验组：将人MSCs接种在人羊膜上培养4d后移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型;对照组：仅采用羊膜移植到兔角膜缘干细胞缺损的动物模型。分别于移植后第1、第2、第3、第4和第6周,摘取各组眼球,分别行HE和PAS染色、单克隆抗体AE1和PCNA染色、透射电镜和扫描电镜检查。结果人MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长,与羊膜共培养4d后,人MSCs贴附羊膜生长迅速,组织学特征无明显改变。羊膜负载人MSCs移植到兔角膜基质表面,角膜表层细胞PAS染色呈阴性,AE1和PCNA染色呈阳性,具有典型的上皮细胞形态;而对照组PAS染色呈阳性,AE1和PCNA染色呈阴性。超微结构观察可见,实验组电镜下可见微绒毛、桥粒和张力丝等典型上皮细胞结构,而对照组未见以上明显特征。结论羊膜负载人MSCs移植到兔眼表角膜基质后,MSCs能存活、增殖并向角膜上皮样细胞分化。     

超低温冷藏对体外培养兔角膜缘上皮细胞活性的影响

目的 分析超低温冷藏兔角膜缘上皮细胞活性变化.设计实验性研究.研究对象超低温冷藏兔角膜缘上皮单细胞悬浮液/兔角膜缘上皮单细胞悬浮液.方法 采用NIH 3T3饲细胞培养体系,将角膜缘上皮制成单细胞悬浮液后-182℃冷藏1周,复苏后行体外培养.以角膜缘上皮单细胞悬浮液为对照组.通过测定细胞贴壁时间、分裂周期、MTT值、3H-胸苷值分析细胞代谢和增殖活性,测定单克隆形成率分析干细胞性,采用AE5免疫组织化学方法鉴定培养上皮细胞,HE染色观察培养角膜上皮细胞形态,PAS染色鉴别结膜杯状细胞.主要指标细胞贴壁时间,分裂周期,MTT值,3H-胸苷值,单克隆形成率及角膜上皮细胞形态等.结果 体外培养超低温冷藏、复苏兔角膜缘上皮细胞的细胞贴壁率、分裂周期、单克隆形成分别为(73.16 13.36)%,(25.42±18.73)小时,(13.17±2.87)%,对照组为(74.89±15.72)%,(20.04±9.70)小时,(15.17±3.25)%.细胞代谢、增殖力也较对照组弱(P>0.05).HE染色示细胞形态、结构无差异,AE5免疫组化染色均为阳性,而PAS染色均为阴性.结论 超低温冷藏可降低体外培养兔角膜缘上皮细胞生物学活性,但其影响有限不足以改变细胞生物学特性和在眼表修复中的应用.(眼科,2008,17:108-112)     

人胚肺成纤维细胞饲养兔角膜上皮和内皮细胞的体外培养

目的 研究人胚肺成纤维饲细胞体外培养兔角膜上皮和内皮细胞。方法 人胚肺成纤维细胞系细胞。经丝裂霉素C处理成饲细胞,兔角膜上皮和内皮细胞组织块原代培养,消化接种于人胚肺饲细胞瓶传代培养,体外培养的角膜上皮和内皮细胞行常规病理形态学检查。角膜上皮细胞行角蛋白,内皮细胞行神经烯醇化酶免疫组化染色检测。结果 人胚肺成纤维细胞形态均一。易于分辨,经丝裂霉素处理后推动增殖能力。角膜上皮和内皮细胞原代培养5-7天。细胞密集,经人胚肺饲细胞共培养5代。细胞无衰老现象,检测角膜上皮细胞角蛋白,内皮细胞神经烯醇化酶表达阳性,人胚肺饲细胞表达阴性。结论 人胚肺饲细胞能够明显增强角膜上皮和内皮细胞的体外生存能力。提高细胞的增殖能力。     

壳聚糖复合共混膜培养兔角膜缘上皮及其移植

目的 探讨壳聚糖、胶原、透明质酸钠复合共混膜作为兔角膜缘上皮细胞体外培养载体及其自体移植的可行性。方法 活体取兔左眼角膜缘浅层小块，置此共混膜上，常规培养8天。将兔右眼角膜浅层基质分离成囊袋，用3mm环钻去除角膜中央浅表层，将含培养角膜缘上皮细胞的共混膜植入自体角膜囊袋内(6只兔)，对照组则植入不含细胞的共混膜(6只兔)。术后观察1月。结果 角膜缘小块在共混膜上培养生长良好，移植手术后40h，实验组5／6角膜植片荧光素染色阴性；对照组术后4天角膜植片荧光素染色仍为部分阳性。实验组组织学检查显示材料表层上皮完整，AE1／AE3免疫组化染色阳性，材料部分降解。结论 壳聚糖胶原透明质酸钠共混膜可作为培养角膜缘上皮细胞及其移植的载体。     

兔角膜缘干细胞两种培养方法的比较

目的对采用消化法和组织块法培养兔角膜缘干细胞进行对比,以期确定合理的角膜缘干细胞体外培养方法。方法采用3T3成纤维细胞滋养层培养体系,分别用消化法和组织块法培养兔角膜缘上皮细胞,用免疫组织化学技术检测培养的细胞中ΔNp63的表达。采用流式细胞技术分析分离的角膜缘上皮细胞悬液中间质细胞的含量,采用扫描电镜观察去除上皮的角膜缘基质表面。结果采用消化法培养,培养的细胞中ΔNp63表达较多,细胞最终可以分化为复层上皮结构。在分离的细胞悬液中,间质细胞含量小于5%,扫描电镜显示角膜缘上皮细胞能被完全消化。结论在角膜缘干细胞的培养中,在干细胞的含量方面,消化法培养要明显优于组织块法培养。     

羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗

目的　探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法　在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月。其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气_液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损。进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察。结果　角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固。实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点。但眼睑闭合不全可导致手术失败。对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。结论　以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。     

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞（AECs）体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔（27～28孕周）的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子（EGF）的DMEM／F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1／AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3／12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1／AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

Comparison of cell-suspension and explant culture of rabbit limbal epithelial cells

Currently, most investigators directly use limbal explants to culture corneal epithelial cells. However, it has not been identified that limbal stem cells do readily migrate from the limbal explants onto culture plate or amniotic membrane carrier. In this study a cell-suspension culture system for rabbit limbal stem cells was developed and compared with the direct explant method in the aspect of stem cells content in the culture system. Rabbit limbal epithelial cells were dissociated from rabbit eyes by dispase and single cell suspension was made for cell-suspension culture. DeltaNp63 expression of cultured rabbit limbal epithelial cells by cell-suspension technique and explant technique was detected. In cell-suspension culture, isolated cell-suspension was evaluated by flow cytometric analysis for vimentin expression and residual limbal tissue after dispase treatment was examined by scanning electron microscopy. In limbal epithelial cells suspension less than 5% cells were vimentin positive. Examination of residual limbal tissue confirmed that all the limbal epithelial cells had been removed. Histological examination revealed that with cell-suspension culture the cultured epithelial cells could differentiate better than with explant technique. In cells cultured with cell-suspension, there were much more cells expressing DeltaNp63 than in explant cultured cells. In cells cultured with explants, most of DeltaNp63 labelling cells mustered around the explants, and peripheral cells on the slides were DeltaNp63 negative. These results suggested that with pure limbal epithelial cells suspension including basal cells, which could directly enter into culture system, cell-suspension culture technique was significantly superior to explant culture technique in terms of stem cells content.     

人角膜上皮干细胞生物学特性的研究

目的 建立人角膜上皮干细胞体外培养体系，并探讨体外培养的人角膜干细胞的鉴定方法，从其生物学特性方面，为角膜上皮干细胞移植奠定基础。方法 采用低钙培养法对人角膜缘基底层细胞组织块进行培养。从生长特性、光镜特征、超微结构特点以及免疫细胞化学方面进行鉴别。结果 培养细胞呈多边形典型上皮细胞形态生长。电镜下可见张力丝等典型上皮细胞结构。单克隆抗体4Gl0．3染色，大部分阳性；AE5染色，绝大多数为阴性。结论 用无钙培养基与低钙培养基结合可获得较纯的、未分化的角膜干细胞。其鉴定应综合鉴别。     

胎儿角膜缘干细胞的培养和生物学特性观察

角膜缘干细胞(limbalstemcells,LSC)及利用角膜缘干细胞移植(limbalstemcellstransplantation,LSCT)重建眼表的研究正在国内外广泛展开。而实行LSCT其前提是必须有LSC供体,尽管当前LSC的来源有自体、同种异体和体外培养的自体及同种异体等几种,但均有其局限性。人胎儿细胞的增殖和分化潜能较成人同类细胞大,此外,胎儿的免疫系统没有发育完善,胎儿组织存在免疫宽容现象[1]。贾卉等[2]研究还发现,胎儿角膜中与免疫反应有关的细胞和细胞间黏附分子较成人少,故胎儿器官、组织或细胞移植较少甚至无免疫排斥反应发生。因此,为探寻一种新的…     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

培养的同基因兔角膜缘干细胞移植治疗兔眼表烧伤

目的:探讨培养的同基因兔角膜缘细胞移植治疗眼表疾病的方法和疗效。方法:采用消化培养法,兔角膜缘组织进行体外培养,载体为冰冻保存人羊膜,培养的细胞形成单层后移植到已去除病变组织的碱烧伤兔眼球表面,6例兔三度碱烧伤眼进行了培养的同基因兔角膜缘干细胞移植,通过HE染色和免疫荧光染色法,观察眼表结构的愈合情况。结果:术后上皮化进程加快(2～3wk,P<0.05),2mo内均形成较稳定的眼表上皮结构,角膜轻度血管化和结膜化。结论:培养的同基因角膜缘干细胞移植术可作为治疗眼表烧伤、重建眼表的有效方法。     

Conjunctival epithelial cells cultured on human amniotic membrane fail to transdifferentiate into corneal epithelial-type cells

PURPOSE: Previous studies on the use of human amniotic membrane (HAM) in rabbit stem cell deficiency models have found the new epithelium growing over the HAM to express cornea-specific keratins (K3 and K12) in 40% of the cases, suggesting that HAM may have induced conjunctival epithelial cells to transdifferentiate into cornea-type epithelial cells. The current study was performed to determine whether HAM could induce transdifferentiation of conjunctival epithelia] cells when cultured in vitro. METHODS: Conjunctival grafts taken from the fornices of New Zealand white rabbits (6-12 weeks old) were placed over HAMs and lifted to an air-media interface using polypropylene double rings. These cultures were maintained in supplemented hormonal epithelial medium with and without 3T3 feeder cells. Rabbit corneal epithelial cells were cultured similarly using strips of keratolimbal grafts placed over HAM. The cultures were terminated at various times between the 8th and 15th day. The cultured epithelial cells were examined histologically and immunohistochemically using monoclonal antibodies AK-2 (to K12 keratin), AM-3 (to goblet cell mucin), and AE-5 (to K3 keratin). RESULTS: Both conjunctival and corneal epithelial cells cultured on HAMs showed multilayered, differentiated epithelial structures. On immunohistochemical examination, both epithelial cells stained positive for AE-5. None of the cultured conjunctival epithelial cells stained positively for AK-2, while the corneal epithelial cells showed positive staining with AK-2. There were no AM-3-positive goblet cells in either epithelial cell culture. There was no difference in the immunohistochemical patterns between cultures with or without 3T3 feeder cells. However, culture without feeder cells seemed to manifest a more degenerative appearance than those with feeders. CONCLUSION: HAM does not induce transdifferentiation of conjunctival epithelial cells into corneal-type epithelial cells under the in vitro culture conditions used in this study.     

3D共培养模型对体外培养兔角膜缘干细胞的影响

目的　探讨三维（three-dimension，3D）共培养模型对体外扩增兔角膜缘干细胞（limbal stem cells，LSCs）的作用。方法　体外培养兔LSCs，以牙周膜干细胞（human periodontal stem cell，HPDLSCs）作为饲细胞建立共培养模型，根据载体不同分为3组，纤维蛋白胶组:将兔LSCs、HPDLSCs、纤维蛋白胶3D共培养；羊膜组:将兔LSCs、HPDLSCs、羊膜3D共培养；对照组:将兔LSCs、HPDLSCs共培养。共培养5 d后，用倒置显微镜、HE染色、扫描电镜观察兔LSCs的细胞形态，采用免疫荧光染色检测各组兔LSCs阳性标志物p63的表达，并比较各组p63的阳性率。结果　共培养5 d后，倒置显微镜、HE染色观察细胞形态，羊膜组、纤维蛋白胶组细胞排列紧密，呈大小不等的团块状集落，细胞大小基本一致；对照组细胞排列相对稀疏；扫描电镜下观察见纤维蛋白胶组和羊膜组细胞与载体贴附良好。免疫荧光染色显示纤维蛋白胶组、羊膜组和对照组LSCs的p63阳性率分别为（69.93±8.76）％、（78.36±8.56）％和（58.59±8.31）％，三组间总体比较差异有统计学意义（F=9.43，P=0.000）。两两比较中纤维蛋白胶组、羊膜组LSCs的p63阳性率均大于对照组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。纤维蛋白胶组、羊膜组的p63阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论　以纤维蛋白胶、羊膜作为载体，HPDLSCs作为饲细胞的3D共培养模型有助于体外扩增兔LSCs。     

培养兔自体角膜缘干细胞移植的实验研究

目的 观察以羊膜为载体的兔角膜缘于细胞膜片移植治疗兔角膜缘于细胞缺损的效果。方法 制造兔角膜缘干细胞缺损的动物模型,以右眼为实验眼,从兔左眼取角膜缘组织,将兔角膜缘干细胞消化下来,接种于铺有羊膜的无菌六孔培养板中,待细胞形成多层角膜上皮细胞后,对兔角膜缘干细胞缺损动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行裂隙灯及病理学检查。结果 临床和组织病理学染色证实：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增生、分化为多层角膜上皮细胞;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少或消失。结论 应用角膜缘干细胞羊膜移植术可恢复其角膜上皮结构的完整性,减少角膜新生血管的形成,维持角膜缘的细胞屏障功能。     

角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究

目的:探索角膜基质接触诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES.细胞)定向分化的可能性。方法:分别在去上皮的新西兰白兔表层角膜缘基质上、晶状体上皮细胞饲养层上培养ES-D_3细胞,裸鼠皮下移植使其形成复层细胞,一段时间后,行扫描电镜和光镜观察。结果:I.ES细胞在新鲜表层角膜缘基质上增殖缓慢,2～3周形成较大细胞集落,光镜下细胞形态单一,体积较正常ES细胞大,电镜下细胞核已演变为细长形,移植到裸鼠皮下2周形成上皮样细胞复层,电镜下可见微绒毛,而角膜基质非上皮面的ES细胞仍保持其小细胞状态不变。2.晶状体上皮细胞与ES细胞共培养只能延缓其分化时间,不能诱导其定向分化。结论:表层角膜缘基质具有诱导ES细胞定向分化的潜能,体外培养条件下可能不发生晶状体诱导的第三级胚胎诱导。眼科学报1999;15:195-198。