超声热疗联合顺铂治疗口腔鳞癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的 通过观察超声加热及联合顺铂对人舌癌裸鼠移植瘤的疗效及其对正常组织的影响，评价超声热疗与化疗药物联合应用的效应。方法 裸鼠背部皮下接种Tca8113细胞后，随机分为4组，分别进行以下处理：(1)局部超声热疗；（2)顺铂(CDDP)化疗；（3)超声热疗联合CDDP化疗；（4)平行对照。治疗结束后观察4周，评价指标为：(1)肿瘤体积的动态观察；（2)按肿瘤体积、瘤重计算抑瘤率；(3)计算热增比，评价热疗与化疗联合应用的效应。结果 根据肿瘤体积动态观察，单独应用超声热疗或顺铂化疗均可导致肿瘤生长抑制，瘤重抑瘤率分别为78．11％和18.43％。超声热疗联合顺铂化疗取得了明显的治疗效果，瘤重抑瘤率为97．86％，热增比为1．2。结论 超声加热技术温度控制准确、可靠，适合个体化治疗的要求。超声热疗联合CDDP具有明显的抑瘤效应，两者具有协同作用。     

低剂量环磷酰胺联合树突状细胞瘤苗对荷舌鳞癌裸鼠的治疗观察

目的：观察低剂量环磷酰胺与树突状细胞瘤苗联合应用对裸鼠体内人舌癌细胞的抑瘤作用。方法：培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC），冻融法制备Tca8113舌癌细胞可溶性抗原并体外致敏DC，将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL，联合低剂量环磷酰胺（Cy）共同接种至荷人舌癌的裸鼠。结果：抗原致敏的DC瘤苗与小剂量环磷酰胺联合后能比单用DC瘤苗更有效的治疗荷舌癌的裸鼠，与对照组相比，肿瘤生长明显抑制，生存率有显著提高（P〈0．05）。结论：以冻融抗原致敏的DC激活产生肿瘤特异性的CTL联合小剂量Cy能更有效的促进荷瘤宿主的免疫反应，具有显著的体内抑制舌癌的效果。     

Fas转染及抗体处理对舌鳞癌细胞Tca8113移植瘤形成和增殖的影响

目的　研究Fas转染和抗Fas单克隆抗体对舌鳞癌细胞系Tca8113裸鼠体内移植瘤形成和增殖的影响,探讨相关机制。方法　脂质体法以真核表达重组质粒pBK-fas转染舌鳞癌细胞系Tca8113。部分转染细胞行抗Fas单克隆抗体处理。未转染细胞、Fas转染细胞、Fas转染抗体处理细胞分别接种裸鼠皮下。观测移植瘤生长,绘制生长曲线。RT-PCR检测肿瘤细胞Fas mRNA表达。流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞凋亡、增殖及Fas蛋白表达。结果　Fas转染和抗体处理延迟肿瘤形成,抑制肿瘤增殖。Fas转染上调移植瘤Fas mRNA表达,提高Fas蛋白表达强度和凋亡指数,但不影响Fas蛋白阳性表达率和增殖指数。抗体处理不影响Fas mRNA和蛋白表达,但可提高凋亡指数,降低增殖指数。结论　Fas转染抑瘤效应是上调Fas转录和表达、促进凋亡的结果。抗Fas单克隆抗体抑瘤效应则与激活凋亡和抑制增殖有关。     

HSP70多肽复合物介导的细胞毒性T淋巴细胞对Tca8113细胞的免疫杀伤作用

目的:研究HSP70多肽(HSP70 peptide complexes,HSP70-PC)对人脾细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性及功能的影响.方法:人舌癌Tca8113细胞在43℃条件下加热30min,恢复12h后,用亲和层析方法提纯HSP70多肽,并用Western印迹鉴定;将提纯的HSP70多肽体外刺激人脾淋巴细胞扩增、活化,然后用MTT法测定其对舌癌Tca8113细胞的杀伤作用,并用电镜和相差显微镜观察其培养上清舌癌Tca8113细胞的形态学变化.采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验.结果:1g湿重的肿瘤细胞可提取纯化HSP70蛋白85μg,通过SDS-PAGE和Western印迹证实为HSP70抗原肽复合物;提取舌癌Tca8113细胞的HSP70-PC与体外免疫扩增的人脾淋巴细胞形成致敏CTL,当致敏CTL与Tca8113细胞效靶比为100:1和50:1时,致敏CTL的杀伤率分别为(77.4±2.9)%和(78.9±1.9)%,2组间无显著差异(P>0.05).HSP70诱导的CTL对Tca8113的杀伤率与非抗原刺激的淋巴细胞组比较,有显著性差异(P<0.01),受攻击的舌癌Tca8113细胞出现凋亡的形态学变化.结论:Tca8113细胞来源的HSP70多肽具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的能力,能刺激人脾淋巴细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞的效应,并能介导肿瘤细胞凋亡.     

端粒酶卡侯体蛋白1干扰慢病毒对口腔鳞状细胞癌细胞裸鼠致瘤作用的研究

目的：探测端粒酶卡侯体蛋白1（TCAB1）基因沉默对裸鼠移植瘤生长及肿瘤细胞生物学行为的影响。方法采用定量荧光原位杂交（Q-FISH）方法测定RNA干扰慢病毒shTCAB1和sh阴性对照（NC）处理后经稳定筛选26代人口腔鳞状细胞癌（OSCC）的Cal27细胞系染色体末端端粒的信号强度。然后将RNA干扰的Cal27细胞接种于裸鼠颈部皮下左、右两侧,定期监测肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,称取瘤体重量。采用免疫组织化学检测移植瘤组织中TCAB1、B细胞淋巴瘤蛋白-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3、血管内皮生长因子（VEGF）和细胞周期蛋白D1的表达。结果 Q-FISH结果显示,shTCAB1处理后的Cal27细胞较shNC处理后及野生型Cal27细胞的端粒平均长度明显缩短。shTCAB1处理组OSCC移植瘤生长速度明显较shNC对照组减慢。移植瘤平均重量为0.06 g,对照组为0.26 g,抑瘤率达76.9%。免疫组织化学结果显示,shTCAB1组移植瘤中TCAB1表达明显降低,同时,Bcl-2、VEGF和细胞周期蛋白D1的表达降低,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达升高。结论shTCAB1慢病毒能够明显抑制裸鼠人OSCC移植瘤的生长,其抗肿瘤机制与诱导肿瘤细胞凋亡、延长肿瘤细胞分裂周期及抑制血管生成有关。     

腺病毒介导HSV-TK/GCV与IL-2基因对人涎腺腺样囊性癌的抑制作用

目的探讨腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir,HSV-TK/GCV）与白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）基因联合应用对涎腺腺样囊性癌的抑制和杀伤作用。方法将0.2 ml细胞浓度为2×107/ml的涎腺腺样囊性癌高转移细胞株（salivary adenoid cystic carcinoma cell line withhigh tendency of lung metastasis,ACC-M）的细胞悬液接种于20只裸鼠皮下,建立涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型。随机将20只荷瘤裸鼠分为A组：HSV-TK/GCV和IL-2联合基因治疗组（TK（IL-2组）;B组：HSV-TK/GCV组（TK组）;C组：空病毒组（EGFP组）;D组：ACC-M组;每组5只。分别于瘤体内注射TK（IL-2;TK;EGFP和无菌生理盐水。注射48小时后,对A、B、C组裸鼠每日腹腔注射GCV,D组每日腹腔注射生理盐水,连续10天。最后一次给药后第二天处死裸鼠,观察各组裸鼠的肿瘤体积和瘤重的变化,计算肿瘤生长抑制率;对移植瘤进行组织病理学观察;应用流式细胞仪检测移植瘤的细胞凋亡情况。结果在A组和B组中,ACC-M的生长均受到显著抑制。治疗后体积数减少,与ACC-M组比较差别有极显著性（P〈0.01）。A组和B组抑瘤率分别为91%和76%;光镜下观察A组和B组均出现了明显的细胞凋亡;流式细胞仪检测A组和B组有明显的凋亡峰出现,凋亡率分别为30.55±0.23和13.53±0.32;C组凋亡率为10.07±0.31,D组凋亡率为8.34±0.41%。除C、D组之间差别无明显性外,其余各组之间差别均有极显著性（P〈0.01）。A组和B组的细胞S期比例明显增加,G2/M期比例明显降低。结论 HSV-TK/GCV联合IL-2基因对ACC-M移植瘤有明显抑制作用,抑瘤效果优于单独应用HSV-TK/GCV系统。     

A-NK 细胞对舌鳞癌裸鼠皮下移植瘤抑制作用的实验研究

目的：探讨 A-NK 细胞治疗裸鼠舌鳞癌移植瘤的效果。方法：分离培养人 A-NK 细胞;建立舌鳞癌 Tca8113-Tb 细胞皮下移植瘤模型,随机分为2组（n ＝7）对照组裸鼠瘤旁注射生理盐水,实验组裸鼠瘤旁注射 A-NK 细胞,观察33 d 后,处死裸鼠,剥离移植瘤,称瘤重,绘制肿瘤生长曲线。结果：治疗15～33 d 时实验组肿瘤体积均小于对照组（P ＜0．05）,观察33 d 后,实验组和对照组瘤重（g）分别是为0．96±0．38和3．74±1．22（P ＜0．05）。结论：A-NK 细胞在裸鼠体内具有抗肿瘤效应。     

口腔癌肿瘤浸润淋巴细胞对人舌癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的探讨在体外具有强大细胞毒活性的口腔癌浸润淋巴细胞在体内的抑瘤效果以及化疗药物环磷酰胺（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，Ｃｙ）与肿瘤浸润淋巴细胞（ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＴＩＬ）联合应用治疗口腔癌的可能性。方法将舌鳞癌细胞系Ｔｃａ８１１３注入裸鼠背部皮下建立移植瘤模型，取培养４周的ＴＩＬ联合低剂量Ｃｙ局部注射，观察肿瘤体积变化及肿瘤生长情况。结果①ＴＩＬ＋ｒＩＬ２和ＴＩＬ＋ｒＩＬ２＋Ｃｙ组在３周内抑瘤率较高（分别为：８６１％±０４％和９７７％±０６％），３周后抑瘤作用减弱；②ＴＩＬ＋ｒＩＬ２＋Ｃｙ组抑瘤率较ＴＩＬ＋ｒＩＬ２组高（第８周抑瘤率分别为：２００％±１４％和７５５％±２５％，Ｐ＜００１）。结论口腔癌ＴＩＬ在应用后３周内具较强抑瘤作用，３周后减弱；联合应用Ｃｙ可获得更佳抑瘤效果     

转肿瘤坏死因子-α基因的肿瘤引流淋巴结细胞对人舌鳞癌SCID鼠移植瘤的生长抑制作用

目的探讨在体外具有强大抗瘤活性的经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因转导的肿瘤引流淋巴结细胞（DNL）在体内的抑瘤效果以及与平阳星（PYC）联合应用的可行性。方法将舌鳞癌细胞系Tca8113细胞注入SCID鼠背部皮下建立移植瘤模型，取经TNF-α基因转导的DNL细胞在肿瘤区局部注射，联合应用低剂量PYC，观察肿瘤生长情况。至第8周以瘤重计算抑瘤率，并取瘤体标本经处理后作电镜和TUNEL检查，观察细胞凋亡情况。结果TNF/DNL加重组白细胞介素-2（rIL-2）组和TNF/DNL加rIL-2加PYC组抑瘤率均较高，2组间差异有统计学意义（P<0.05）；TNF/DNL加rIL-2组超微电镜及TUNEL检测均见凋亡细胞，与对照组相比，凋亡指数（AI）较高（P<0.05）。结论经TNF-α基因转导的DNL局部应用具有明显的抑瘤效果，与PYC联合应用抑瘤效果更大。诱导肿瘤细胞凋亡可能是TNF/DNL抗人舌鳞癌的重要机制之一。     

HSV-TK/GCV联合IL-2对人舌癌移植瘤的抑制作用

目的观察HSV-TK联合IL-2对人舌癌细胞生长的抑制作用,并初步探讨其作用机理。方法建立舌癌Tca8113移植瘤动物模型,采用HSV-TK基因联合IL-2基因对人舌癌移植瘤进行裸鼠体内实验。实验分A、B、C、D四个实验组,每组5只裸鼠。A组为对照组,每瘤注射生理盐水;B组为空病毒组,每瘤注射空病毒5×108PFU;C组为单纯TK治疗组,每瘤注射TK5×108PFU;D组为TK联合IL-2治疗组,每瘤注射TK(5×108PFU) IL-2(5×108PFU)。48小时以后,对B、C、D组裸鼠每日腹腔注射GCV,100mg/kg/日,2次/日,连续10天。最后一次给药后第二天处死裸鼠,测量肿瘤重量并计算抑瘤率;光镜观察移植瘤组织学变化,透射电镜观察细胞的超微结构。结果A、B、C、D组裸鼠瘤重量均数分别为:1.52±0.49g,1.44±0.42g,0.91±0.24g,0.36±0.24g。C组的抑瘤率为40%;D组抑瘤率为76%。经统计学检验发现TK组和TK联合IL-2组的肿瘤生长均受到抑制,A组和C组、A组和D组之间有显著性差异(P<0.01)。与单用TK组比较,TK联合IL-2组抗瘤作用明显增强。光镜观察发现,TK组肿瘤组织呈灶状凋亡,可见核固缩的细胞。TK联合IL-2组凋亡细胞增加,肿瘤细胞减少。电镜观察发现,TK组和TK联合IL-2组出现大量的细胞凋亡:凋亡细胞皱缩,胞核体积缩小,染色质浓缩,电子密度增加,呈新月状边集于核膜下。结论TK联合IL-2治疗可显著抑制Tca8113移植瘤的生长,其治疗效果优于TK单独应用。     

舌癌exosomes诱导CTL细胞体外抗瘤效应的观察

目的：研究舌癌exosomes诱导CTL体外抗肿瘤效应。方法：通过连续离心及超滤法从Tca8113细胞培养上清中分离、纯化出exosomes,然后与树突状细胞（DC）共培养,诱导T淋巴细胞活化为CTL。通过乳酸脱氢酶法测定特异性CTL对Tca8113的杀伤效应。采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。结果：exosomes可促使DC成熟。杀伤实验表明：负载exosomes的DC诱导CTL对Tca8113细胞的杀伤率显著高于未用exosomes负载的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞,其差异有显著性（P〈0.01）。结论：Tca8113细胞来源的exosomes负载DC后,可以诱导T细胞成为抗原特异性CTL,具有特异性杀伤肿瘤细胞的功能。     

MHC分子在诱导口腔鳞癌CTL中的作用

目的 探讨肿瘤细胞上的主要组织相容性复合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ,ＭＨＣ）分子在诱导自体口腔鳞癌细胞毒Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ,ＣＴＬ）中的作用。方法 对９例口腔鳞癌中的肿瘤细胞表面人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ,ＨＬＡ）－ＡＢＣ和ＨＬＡ－ＤＲ抗原进行检测,将其中５例ＨＬＡ－ＡＢＣ抗原表达〉５     

Tca8113细胞exosomes的制备、鉴定及体外抗瘤作用观察

目的:探讨舌癌Tca8113细胞能否分泌exosomes,为口腔肿瘤的免疫治疗寻找新方法。方法:采用超速离心及差异密度梯度离心等方法,从Tca8113细胞中分离并纯化exosomes,透射电镜观察其超微结构,Westernblot分析其表面蛋白成分,最后通过与树突状细胞(dendritic cells,DC)及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)等介导的细胞毒性实验来观察exosomes体外抗肿瘤效应。结果:从Tca8113细胞中成功分离并纯化出exosomes,其结构及携带蛋白与其他细胞来源的相似,并发现其分泌的exosomes还携带有肿瘤抗原MAGE蛋白。体外抗瘤实验表明:负载exosomes的DC诱导的CTL对Tca8113细胞的杀伤率明显高于未负载exosomes的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞,有显著性差异(P<0.01)。结论:舌癌Tca8113细胞能分泌exosomes,exosomes携带各种与肿瘤免疫相关的蛋白,负载DC后,可以诱导T细胞成为抗原特异性CTL,具有特异杀伤肿瘤细胞的功能,为口腔肿瘤的免疫治疗开拓了新的途径。     

Activation and regulation of macrophages induced by inoculation of cryodestroyed tumor cells

Cryosurgery provides two prominent features, that is in situ destruction of malignant tumor and potential immunotherapy against tumor. In order to investigate the immunological response after cryosurgery, immunological system of macrophage activation were studied in an experimental tumor system using BALB/c mice and syngeneic Meth-A fibrosarcoma. The mice inoculated the cryodestroyed Meth-A (Cryo-Meth-A mice) acquired antitumor potency in Meth-A challenge test, and the mice inoculated the Mitomycin C treated Meth-A (MMC-Meth-A mice) also acquired antitumor potency. Spleen cells of Cryo-Meth-A mice showed antitumor activity in Winn assay, and spleen cells of MMC-Meth-A mice also showed antitumor activity. The effector cells in Cryo-Meth-A mice were mainly macrophages and natural killer (NK) cells. On the other hand, they were mainly macrophages and cytotoxic T lymphocytes (CTL) in MMC-Meth-A mice. The maximum macrophage cytostatic activity of Cryo-Meth-A mice was noted on 14 days after inoculation (Day 14), whereas it appeared on Day 7 and continued until Day 14 in MMC-Meth-A mice. Macrophages of Cryo-Meth-A mice enhanced the production activity of interleukin 1 (IL-1), interferon (IFN) and prostaglandin E2 (PGE2). On the other hand, macrophages of MMC-Meth-A mice enhanced production activity of tumor necrosis factor (TNF) and increased Ia antigen positive ratio. These findings suggest that macrophages of both groups are activated by different immunological mechanisms. It was found that Cryo-Meth-A played a role as an alpha-IFN inducer, and the macrophages stimulated with Cryo-Meth-A produced alpha-IFN in vitro. Intraperitoneal (i.p.) administration of the anti-alpha-IFN antibody carried down-regulation of macrophage cytostatic activity and NK activity of Cryo-Meth-A mice, whereas MMC-Meth-A mice were not. In addition to these findings, CTL activity enhanced some extent by i.p. administration of the anti-alpha-IFN antibody. These facts suggest that the alpha-IFN have two ways of immunological regulation, the first one is the activation of macrophage cytostatic activity and NK activity, and the other is down-regulation of CTL activity by suppression of Ia antigen expression of macrophages. These results suggest that cryodestruction changes the tumor antigen of Meth-A cells, thereby Cryo-Meth-A induces peculiar immunological response.     

热化疗对颌面部鳞癌细胞热休克蛋白70表达的影响

目的　探讨热化疗对颌面部鳞癌细胞热休克蛋白(HSP)70表达的影响。方法　12例鳞癌患者给予每周2 次,5周10次为1个疗程的热化疗处理。12例患者均静脉注射平阳霉素8 mg,43℃微波热疗40 min。于患者治疗 前及治疗5次后取肿瘤组织制作标本。用SP免疫组织化学法观察肿瘤细胞HSP70的表达。结果　热化疗1疗程 结束后12例患者肉眼未见明显包块,免疫组织化学染色提示治疗中癌细胞HSP70表达增多。结论　热化疗可以 明显提高HSP70在肿瘤细胞中的表达,HSP70通过其抗原递呈等系列免疫效应,发挥抗肿瘤作用。     

放射诱导启动子介导双自杀基因治疗舌鳞癌的实验研究

目的探讨放射诱导启动子介导双融合自杀基因CDglyTK靶向治疗人舌鳞癌裸鼠移植瘤的疗效。方法构建人舌鳞癌裸鼠移植瘤模型．以脂质体为载体介导携放射诱导启动子调控双融合自杀基因的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E-CDglyTK瘤内转染,辅以3Gy放疗,腹腔注射5-氟胞嘧啶和丙氧鸟苷．描绘肿瘤生长曲线,RT—PCR检测CDglyTK的mRNA水平．免疫组化检测细胞核增殖抗原的表达．原位末端标记法检测肿瘤细胞凋亡。结果放射诱导启动子介导的CDglyTK对肿瘤生长有明显抑制作用．RT—PCR可检测到转染后肿瘤细胞CDglyTK的mRNA表达,诱导放疗增强了其表达水平．电泳条带灰度值从0．213±0．023上调至0．279±0．038（P〈0．01）;诱导放疗显著提高疗效,凋亡指数从21．52％上升为32．23％（P〈0．01）,增殖指数由28．36％下降至20．07％fP〈0．01）。结论放射诱导启动子可作为基因治疗分子开关调节CDglyTK基因在人舌鳞癌裸鼠移植瘤中靶向表达．低剂量放射性照射可显著提高其疗效。     

口腔鳞癌细胞过表达MHC-Ⅰ类链相关蛋白A对自然杀伤细胞与细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性影响的实验研究

目的探讨口腔鳞癌细胞过表达MHC-Ⅰ类链相关蛋白A（MICA）对自然杀伤细胞（NK）与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的影响。方法通过绘制细胞生长曲线、检测细胞周期、进行平板集落形成率及裸鼠皮下成瘤等方法对稳定转染并过表达MICA的口腔鳞癌细胞株进行生物学特性鉴定。采用乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术分析口腔鳞癌细胞过表达MICA对NK与CTL细胞杀伤活性及自然杀伤细胞2族成员D（NKG2D）受体表达的影响。结果口腔鳞癌细胞转染MICA基因后主要生物学特性未发生改变,但能显著增强NK与CTL细胞杀伤活性并上调其表面NKG2D的表达,与未转染及转染空白载体的细胞比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论MICA可作为口腔鳞癌免疫基因治疗的潜在靶标,值得进一步研究。