人胰岛素原C肽基因高效表达载体的构建

目的：构建一种快速、高效的人胰岛素原C肽基因的表达载体，为有效地提高重组C肽的产量奠定了基础。方法：以人胰岛素原C肽的基因序列为基础，运用DNA重组技术构建出含5个拷贝的头到尾连接的C肽基因片段的高效表达载体。结果：通过酶切鉴定和DNA测序分析证实，实验成功地构建了人胰岛素原C肽基因的表达载体pMAL—C2E—C5.结论：人胰岛素原C肽基因表达载体pMAL—C2E—C5的成功构建，为进一步研究在大肠杆菌中表达人C肽融合蛋白，继而获得高产的单体C肽奠定了基础。     

人α心钠素多拷贝基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：选用合适的质粒表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人α心钠素,为人α心钠素的下游纯化工作及基因工程菌的中试打下基础。方法：采用ＰＣＲ,克隆及连续亚克隆,序列分析,原核温度诱导表达等方法。结果：ＰＣＲ方法扩增αｈＡＮＰ基因,克隆至原核表达载体ｐＭＳ３１ｂ,热诱导表达融合蛋白。结论：在大肠杆菌中获得了人α心钠素的高表达。     

人α心钠素多拷贝基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 选用合适的质粒表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人α心钠素,为人α心钠素的下游纯化工作及基因工程菌的中试要下基础,方法 采用ＰＣＲ,克隆及连续亚克隆,序列分析,原核温度诱导表达等方法。结果 ＰＣＲ方法扩增α－ｈＡＮＰ基因,克隆至原核载体ｐＭＳ３１ｂ,热诱导表达融合蛋白,结论 在大肠杆菌中获得人α心钠素的高表达。     

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：研究具有生物学活性的人防御素2（HBD2）多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法：PCR扩增不合前导序列的HBD2成熟肽的编码框全长的cDNA片段（smHBD2-cDNA），利用BglⅡ和BamHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD2-cDNA的克隆载体，利用NcolⅠ和HindⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET32-nsmHBD2-cDNA，在大肠杆菌中BL21（DE3）中诱导表达含HBD2的融合蛋白，SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD2多肽。采用液体培养法，测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果：构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD2-cDNA表达载体，1、2和4倍smHBD2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52％、48％和31％；而8倍HBD2-cDNA几乎不合可溶蛋白，目标蛋白以包含体形式表达，集中在不可溶部分。重组HBD2对E．coli K12 D31有较强的抑制作用，在终浓度约为0．4至0．5μg／ml时，90％细胞的生长被抑制。结论：采用融合表达、多拷贝串联表达方式，可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用，也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性；适当的多拷贝串联基因可以提高HBD2的产量，但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量，且易形成不溶蛋白；在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD2多肽的原核高效表达。     

肽抗生素hPAB-β基因串联体的构建及原核细胞表达初探

目的：构建肽抗生素hPAB-β基因多拷贝串联体重组质粒，实现目的基因串联产物在大肠杆菌中的高效表达。方法：以表达质粒pQE-32为载体，利用同裂酶Pst Ⅰ与Ava Ⅲ能产生相同粘端的特性，通过PCR扩增、酶切、连接、转化等操作，构建含不同数目hPAB-β基因的串联体。对获得的重组菌用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达，Tricine—SDS—PAGE观察串联体融合蛋白的表达情况。结果：构建了一至八拷贝的串联体重组质粒，经酶切、DNA测序分析表明，各串联体的DNA序列及阅读框完全正确。Tricine蛋白电泳显示，各串联体的阳性转化菌株经IPTG诱导后均能表达出目的融合蛋白，相对分子质量与预期结果相符，表达量占细菌总蛋白的10％～22％。但八拷贝较其他串联体表达率有所降低。结论：hPAB-β基因串联体重组表达质粒的成功构建，为大量制备目的肽抗生素奠定了基础，并为其他小分子生物活性肽的制备提供了参考。     

人骨形成蛋白4成熟肽cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的cDNA基因,并在大肠杆菌中表达．方法：从人胎盘组织中提取总RNA,以其为模板,采用RT—PCR方法得到编码hBMP4的成熟肽段(hBMP4m)cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达．结果：获得hBMP4m cDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证实所插入的hBMP4m cDNA序列与设计预期一致;将获得重组表达质粒pDH2-hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,目的蛋白占细菌总蛋白的41．5％．结论：采用分子克隆的方法得到编码hBMP4成熟肽段的cDNA,克隆入表达载体,在大肠杆菌中成功获得hBMP4成熟肽的高效表达。     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因的克隆及原核表达

目的分离人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因，并在E．coil中获得表达。方法以人的白细胞基因组DNA为模板，合成特异引物，采用PCR技术分离得到hGDNF成熟肽基因，并构建表达载体pET-21a( )-hGDNF，转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别用IPTG和乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳检测hGDNF蛋白表达。结果PCR扩增出了400bp的DNA片段，构建的表达载体pET-21a( )-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现400bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG或乳糖诱导转化菌均有15kd大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白30％以上，以包涵体形式存在。结论克隆得到人GDNF成熟肽基因并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

重组人骨形成蛋白—2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

利用大肠杆菌系统高效表达人骨形成蛋白－２成熟肽。方法；将编码人骨形成蛋白２成熟肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体ｐＤＨ上，使其受控于ＰＲＰＬ启动子，构建成表达质粒ｐＤＨＢ２ｍ，以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，表达产物初步纯化后进行复性处理，用小鼠肌袋模型检测产物诱骨活性。     

蟹多拷贝重组金属硫蛋白的原核表达载体构建及表达

目的：在大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS中表达中华绒螯蟹金属硫蛋白基因多拷贝串联重组基因.方法：将中华绒螯蟹金属硫蛋白（MT）基因通过PCR方法引入适当的限制性内切酶位点,通过T-A克隆,双酶切得到两端含内切酶位点的各单拷贝片段,再逐一利用引入住点插入到pET-15b原核表达载体中,载体转化大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS,经过酶切和测序鉴定验证,得到含重组质粒的工程菌.结果：成功构建了与His标签融合表达的含2拷贝和3拷贝中华绒螯蟹金属硫蛋白基因的重组质粒.摸索了不同的pH、IPTG、温度条件、锌离子浓度、菌体OD值、诱导时间后,选择最佳条件,成功高效地表达了与His融合的2拷贝和3拷贝的金属硫蛋白,目标蛋白表达量分别占菌体总蛋白的40%和45%.结论：成功制备了金属硫蛋白的工程菌并获得高效表达目标蛋白,为金属硫蛋白的科学研究和工业化大规模生产应用打下了坚实的基础.     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of mtrC Protein of Neisseria gonorrhoeae and Its Expression in E.Coli

Gonorrheais one of the most common venerealdiseases.The wild use of antibiotic againstNeisse-ria gonorrhoeaehas made the drug resistance a bigproblemin the prevention and treat ment of gonor-rhea.Besides the drug resistance mediated bychange in structure of penicillin-binding protein,mutation of DNAgyrase A,chromosome plasmid,another non-specificity multi-drug resistant mecha-nismofNeisseria gonorrhoeae,multiple transfera-ble resistance efflux system,has been paid closeattention to increasin…     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of Fusion Protein Including Porin A and Porin B of Neisseria Gonorrhoeae and Its Expression in E.coli

Neisseriagonorrhoeaeisacommonpathogenicmicroorganismwhichcausessextransmitteddisease .Therewereanestimated 6 0millionnew gonococcalinfectionsworld widein 1999.Theporins ,thepre dominantproteinsonthesurfaceofpathogenicNeis seria ,formafamilyofstructurallyr…     

人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白的融合表达及其体内靶向性研究(英文)

目的:探讨人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白(EGFP-SA3)的融合表达、纯化、复性及其体内靶向性。方法:将SA3,EGFP基因,插入pET-25b(+),构建EGFP-SA3/pET-25b(+)原核表达载体,测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导融合蛋白EGFP-SA3的表达,复性、纯化后经SDS-PAGE鉴定;EGFP-SA3与HepG2细胞经体外孵育后在荧光显微镜下观察单链抗体SA3与肝癌细胞的结合作用;然后通过尾静脉将其注射入荷肝癌裸鼠体内观察EGFP-SA3的体内靶向作用。结果:SA3,EGFP基因分别插入载体pET-25b(+)后,重组表达载体EGFP-SA3/pET-25b(+)分别行NcoI-XhoI和NcoI-EcoRI双酶切,结果发现在750 bp左右出现一条带,与EGFP基因大小一致,在1.5 kb左右处出现一条带,与EGFP和SA3两个基因片段的总大小一致,DNA测序结果证实融合表达载体EGFP-SA3/pET-25b(+)构建成功;重组表达载体EGFP-SA3/pET-25b(+)经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示融合蛋白EGFP-SA3分子质量...     

十二指肠钩虫ASP-2基因密码子优化及在大肠杆菌中高效表达

目的:获得十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)分泌蛋白2(mAd-ASP-2)编码基因,构建其高效表达的大肠杆菌表达体系?方法:以RT-PCR的方法得到克隆了编码mAd-ASP-2的成熟肽全基因序列,克隆入原核表达载体pET-22b(+)中,组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2?利用大肠杆菌偏爱密码子和GenScript rare codon analysis 软件获得优化密码子优化的mAd-ASP-2*基因序列并人工合成该基因,将其克隆入原核表达载体pET-22b(+),组装成表达载体pET-22b-mAd-ASP-2*?将这2个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami-2(DE3)中,经IPTG诱导表达?结果:同样条件下,密码子优化的mAd-ASP-2*基因比优化前能够获得较高的表达,且以可溶形式存在?利用His Trap HP亲和柱获得了纯化的重组蛋白mAd-ASP-2*,确定了纯化重组蛋白咪唑洗脱液最佳浓度为200 mmol/L?Western blot分析结果进一步显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白?结论:通过密码子优化实现了十二指肠钩虫ASP-2的高效表达,为进一步研究Ad-ASP-2的功能和以其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础?     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

重组 CARDs TX 融合蛋白的表达纯化与复性

目的:构建 pET28α-CARDs TX 重组质粒,诱导 CARDs TX 融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将 CARDs TX 基因（MPN 372）克隆入 pET28α 载体,经 8 次点突变获得 pET28α-CARDs TX 重组质粒。转化大肠杆菌 BL21,IPTG 诱导表达。利用亲和层析技术纯化蛋白并通过 SDS-PAGE 和 Wetern Blot 检测 CARDs TX 的表达和纯化效果。利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究。结果:酶切和测序结果证明 pET28α-CARDs TX 重组质粒的 DNA 序列完全正确,在 BL21 中 CARDs TX 融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白。利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果。 结论:成功构建出 pET28α-CARDs TX 重组质粒,且 CARDs TX 可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究 CARDs TX 的生物学特性奠定了基础。     

Construction and expression of the fusion vector of His-tagged human ARPC2 gene]

OBJECTIVE: To construct the expression vector of His-ARPC2 fusion protein and obtain its expression and purification in E. coli. METHODS: ARPC2 cDNA codon region was amplified by PCR from human liver cDNA library and cloned into pET-14b vector following the routine procedures. After identification by enzyme digestion, PCR and sequencing, the positive clones were transformed into BL21 (DE3) competent cells, and the expression of His-ARPC2 fusion protein was induced with IPTG and further purified by Ni-NTA affinity chromatography. RESULTS: The constructed His-ARPC2 fusion protein vector was highly efficiently expressed in E. coli. With Ni-NTA affinity chromatography, a purified His fusion protein with relative molecular mass of approximately 36 000 was obtained. CONCLUSION: The expression vector of His-ARPC2 fusion protein is constructed, expressed and purified under non-denaturing conditions, which may significantly facilitate future study of the physiological functions of ARPC2 and characterization of its interaction proteins.     

人ARPC2基因的克隆与表达

目的 构建人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中进行表达与纯化,以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法从人肝cDNA文库扩增ARPC2基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pET-14b载体中。对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株,用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果 所构建的人ARPC2的His融合蛋白表达载体是正确的,该载体可在大肠杆菌内高效表达,用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36 000的融合蛋白。结论 成功构建了人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中获得了高效表达和纯化,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。