草原兔尾鼠GST-LZP3融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 :在原核中表达并纯化草原兔尾鼠卵透明带 3 (zonapellu cida3 ,ZP3 ) ,并以其作为抗原 ,制备抗ZP3的抗血清。方法 :将LZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX 4T 1中。经酶切和序列分析后 ,用重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,并经丙基β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST LZP3融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。结果 :成功地构建GST LZP3融合蛋白表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST LZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST LZP3融合蛋白的高效价抗血清。结论 :获得原核表达的GST LZP3融合蛋白并制备了兔抗LZP3的抗血清 ,为采用免疫不育技术进行草原兔尾鼠生育控制的研究提供了重要的制剂     

候选hEra结合蛋白A19/GST的融合表达及其抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达候选人Era结合蛋白A19/GST融合蛋白,并制备兔抗A19抗体。方法:利用人Era蛋白全长作为诱饵,进行胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选。将得到的候选人Era结合蛋白A19的编码基因序列克隆入pACT2载体中,构建pACT2A19。用PCR扩增A19蛋白的编码基因序列,克隆入融合表达载体pGEX4T3中,构建A19的表达菌,并经IPTG诱导表达A19蛋白。用SDSPAGE分析及薄层扫描检测目的蛋白的含量。用A19蛋白免疫家兔制备抗血清,以Westernblot鉴定抗体的特异性并检测抗体的效价。结果:大肠杆菌中表达的A19蛋白占菌体总蛋白的30.2%。Westernblot分析显示,抗血清具有较高的特异性,其效价约为1∶4000。结论:成功地获得了候选的人Era结合蛋白A19,制备了兔抗A19抗血清,为后续Era功能的研究奠定了基础。     

汉滩病毒M、S基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段。方法将汉滩病毒76118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7kb的片段连接,克隆入pGEX4T2,构建嵌合基因原核表达载体pGEX4T2G1S0.7,并在大肠杆菌XL1Blue中,诱导GSTG1S0.7融合蛋白的表达。表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定。结果成功地构建了嵌合原核表达载体pGEX4T2G1S0.7。经IPTG诱导后,ELISA活性测定结果表明,该融合蛋白可与抗汉滩病毒NP及糖蛋白的mAb特异性结合。Westernblot结果显示,诱导出相对分子质量Mr大于1×105的G1S0.7与GST的融合蛋白。结论获得具有特异性结合活性的融合蛋白GSTG1S0.7,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

Heymann肾炎受体相关蛋白融合蛋白的实验研究

通过Heymann肾炎受体相关蛋白的研究 ,探讨Heymann肾炎的分子发病机制。运用基因重组技术 ,将编码受体相关蛋白羧基端 10 8个氨基酸多肽 (RAP3 2 4 )的cDNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pGEX。通过异丙基硫代 β D半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,表达了分子量为 44× 10 3 的融合蛋白。经GST Sepharose4B亲和层析柱 ,纯化了融合蛋白。表达产物经Westernblot分析。羧基端受体相关蛋白融合蛋白在pGEX中得到高效表达 ,其分子量为 44× 10 3 。每升培养液纯化到 2 0～ 30mg的融合蛋白。Westernblot分析表明抗RAP3 2 4 融合蛋白的抗血清识别天然肾小管刷状缘膜抗原FXIA中分子量约 44× 10 3 的带。间接免疫荧光显示该融合蛋白抗体结合于肾小管刷状缘。表明受体相关蛋白羧基端 10 8氨基酸多肽链上存在致肾炎的病理性表型。     

小鼠SAP基因的克隆、表达及多抗制备

目的 制备小鼠SAP多克隆抗体,为进一步研究其功能和探讨其与炎症,肿瘤等疾病的相关性提供素材。方法 PCR扩增小鼠SAP基因编码区的DNA片断,将其重组入原核表达质粒pET30a(+),转化入大肠杆菌BL21中,异丙基β-D硫代办乳糖苷（IPTG）诱导产生His/mSAP融合蛋白,SDS-PAGE分析结果表明,蛋白主要以包涵体形式存在。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、Western blot来检测抗血清效价及特异性。结果 成功的构建了pET30a(+)/mSAP重组质粒,表达融合蛋白,免疫兔子所获的mSAP多克隆抗体。结论 mSAP多克隆抗体特异性强,效价高。     

胃癌抗原相关基因MPS-1的融合表达及兔抗GST-MPS-1抗体的制备

目的在大肠杆菌中表达GST-MPS-1融合蛋白并制备兔抗GST-MPS-1抗体。方法将MPS-1全长cDNA克隆至pGEX-5X载体内,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导GST-MPS-1融合蛋白的表达。以分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备抗GST-MPS-1抗体。用Western blot和细胞免疫荧光染色法,检测兔抗GST-MPS-1抗体的特异性。结果经测序和酶切鉴定确认,MPS-1基因以正确的方式插入到载体中。此重组表达载体经IPTG诱导后,可高效表达相对分子质量(Mr)为36000的GST-MPS-1融合蛋白。以融合蛋白免疫兔获得的抗血清,经ELISA检测效价达到1×105。Western blot和细胞免疫荧光染色证实,该多克隆抗体能与MPS-1蛋白特异性结合。结论兔抗MPS-1特异性抗体的获得,为进一步检测MPS-1蛋白的表达和功能分析奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的：原核表达呼吸道合胞病毒（RSV）非结构NSl蛋白,并对其免疫特性进行研究。方法采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a（＋）载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Westernblot法鉴定抗体的特异性。结果重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确．经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达．表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42000Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Westernblot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15000Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带。结论NSl基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应。     

一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的 :克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV)N蛋白的DNA ,构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并诱导表达。方法 :采用RT PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段 ,并克隆入T EASY载体中。经PCR、双酶切鉴定后 ,测序。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX 2T中 ,表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS CoV抗体阳性血清做Westernblot。结果 :N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失 2 0个bp。GST N融合蛋白以可溶形式表达。Westernblot检测表明 ,其与抗SARS CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论 :成功地构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并表达GST N融合蛋白 ,为下一步的研究奠定了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人金属硫蛋白MT-2a的原核表达、纯化及其抗血清的制备

目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫新西兰大白兔,制备抗血清。用双向凝胶免疫扩散和ELISA检测抗血清的效价,用Westernblot检测抗血清的特异性。结果:经诱导表达及亲和层析纯化,每L菌液可获得可溶性融合蛋白GST-MT-2a38mg。以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备的抗血清,双向免疫扩散效价>1∶256,ELISA效价>1×10-7。Westernblot检测证明抗血清的特异性良好。结论:人MT-2a在大肠杆菌中得到高效表达,以纯化的GST-MT-2a可溶性融合蛋白免疫家兔得到高效价、高特异性的抗血清,为进一步研究MT-2a蛋白的生物学功能提供了重要的制剂。     

Preparation and characterization of the polyclonal antibody against pig integrin beta6 subunit LBD as FMDV receptor

AIM: To induce the expression of FMDV receptor integrin beta6 subunit ligand-binding domain in E.coli and prepare the rabbit polyclonal antibody against it. METHODS: The fragment coding beta6 ligand-binding domain was amplified by PCR and doubly digested with BamH Iand Xho I. Then it was cloned into expression vector pGEX-4T-1 to obtain recombinant plasmid pGEX-4T-1-beta6LBD. After pGEX-4T-1-beta6LBD was transformed into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG, the expression of fusion proteins was identified by SDS-PAGE, with inclusion body prepared and fusion protein purified. Then new Zealand rabbits were immunized to prepare polyclonal antibody against beta6LBD. GST-beta6LBD antiserum was obtained and the specificity of polyclonal antibody was detected by Western blot. RESULTS: SDS-PAGE demonstrated that the fusion protein GST-beta6LBD was expressed with the expected molecular weight at 42 000. A single clear band of GST-beta6LBD fusion protein appeared in SDS-PAGE gel after purification. The titer of the polyclonal antibody was above 1:12 800 and it is of high specificity. CONCLUSION: The successful preparation of rabbit anti pig beta6LBD polyclonal antibody with high affinity and specificity will lay a foundation for further research into the function of integrin beta6 in FMDV infection.     

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子4（GST－PF4）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法 通过RT－PCR方法，从HL－60细胞中克隆PF4cDNA，然后克隆至载体pUC19中，序列测定后把PF4基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEC-4T-3中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果 获得了PF4 cDNA。序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已正确插入到pGEX-4T-3中。重组融合蛋白表达载体GST－PF4经IPTG诱导表达，在SDS－PAGE后得到1条蛋白表达带，相对分子质量（Mr)约为36000。结论 成功地构融合蛋白表达载体GST－PF4，并大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

GST-snail融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的制备snail多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法PCR扩增编码人snail 264个氨基酸的cDNA全长片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β—D-硫代半糖苷（IPTG）诱导表达GST／Snail融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹法鉴定血清特异性和效价。结果成功构建了pGEX-4T-1／snail原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白GST—snail,免疫产生的snail多抗可特异检测snail真核表达载体转染COS-7细胞后snail的表达及定位情况。结论获得了效价和特异性都良好的snail抗体,适合对snail的检测应用。     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

CMTM1-v17/CKLFSF1-v17多克隆抗体的制备、亲合纯化与鉴定

目的：CMTM1-v17是我室克隆的人类新基因，为进一步研究CMTM1-v17的功能，需制备高纯度的CMTM1-v17的抗体。方法：根据生物信息学分析的结果，用PCR法扩增人CMTM1-v17分子C端的cDNA片段（编码118～149位氨基酸），亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-2上。将重组质粒pGST-CMTM1-v17导入大肠杆菌BL21，诱导表达GST-CMTM1-v17 C端融合蛋白，经GST亲合层析、凝血酶切割后获得CMTM1-v17 C蛋白作为抗原免疫家兔制备抗血清。抗血清经抗原亲合层析后用Western blot和免疫组化方法进行鉴定。结果：通过重组表达获得抗原蛋白，免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗CMTM1-v17抗体，该抗体能检测到CMTM1-v17超表达和细胞内源性的蛋白。结论：成功制备了抗CMTM1-v17的多克隆抗体，对进一步研究CMTM1-v17的功能提供了一个有用的工具。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。