缺血缺氧再灌注不同损伤程度人脐静脉内皮细胞变化与清开灵的干预效应

背景:"毒损脑络"是急性脑血管病的主要病机,以脑微血管损伤为主要表现.目的:建立不同缺氧缺血再灌注时间的细胞模型及施加药物干预,观察清开灵注射液对不同损伤程度人脐静脉内皮细胞ECV304的保护作用.设计:以培养的细胞为观察对象的随机对照实验.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科.材料:实验于2002-02/04在北京中医药大学附属东直门医院中心实验室完成.实验用人脐静脉内皮细胞ECV304随机分为7组,即正常组、缺氧6 h再灌注12 h对照组、缺氧234h再灌注12 h对照组、缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组、缺氧6 h再灌注12 h中浓度清开灵组.清开灵注射液主要成分为牛胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子总苷等.方法:缺血再灌注模型的制作:①从培养箱中取出培养的细胞,缺氧6 h再灌注12 h对照组、缺氧24 h再灌注12 h对照组分别吸除原培养液,换入无糖Earle's液,细胞放入缺氧槽中37℃缺血缺氧培养.缺氧6 h再灌注12 h对照组培养6 h,缺氧24 h再灌注12 h对照组培养24 h后,分别吸去无糖Earle's液,换入无血清1 640液后置于37℃CO2培养箱中再灌注培养12 h.②缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组分别在缺氧24 h再灌注12 h对照组造模的基础上,向各自培养液中加入质量浓度为5,10,20mg/L的清开灵对细胞进行培养.③缺氧6 h再灌注12 h中浓度清开灵组在缺氧6 h再灌注12 h对照组造模的基础上,向培养液中加入质量浓度为10 mg/L的清开灵.④细胞存活率以四唑盐比色试验测定,乳酸脱氢酶漏出率用乳酸脱氢酶试剂盒测定,细胞凋亡率行碘化吡啶染色后用流式细胞仪检测,Cellquest软件进行分析.主要观察指标:①细胞形态学观察结果.②各组细胞存活率、乳酸脱氢酶漏出率及细胞凋亡率.结果:①细胞形态学观察:正常组细胞密集,贴壁良好,伸展充分,细胞表面光滑,有较多的分裂期细胞,细胞长满底面,呈典型的"铺路石征";缺氧6 h再灌注12 h对照组及缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组细胞形态改变不明显;缺氧24 h再灌注12 h对照组细胞较稀疏,脱壁较多,可见大量肿胀变圆的损伤细胞及破碎细胞的碎片,贴壁细胞皱缩明显,可见伪足,分裂期细胞少;缺氧24h再灌注12 h中浓度清开灵组细胞贴壁良好,表面光滑,未发生皱缩,可见分裂期细胞.②各组ECV304细胞存活率:与缺氧24 h再灌注12 h对照组比较,缺氧24 h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组均显著升高[(42.5±2.8),(72.9±8.0),(80.3±12.7)%,P均＜0.01],而缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组则显著下降至(10.1±0.4)%,P＜0.01.正常组为100%.③各组ECV304细胞乳酸脱氢酶漏出率:与缺氧24 h再灌注12 h对照组比较,缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组均显著升高[(6.6±1.4),(2.4±1.4),(2.4±0.5)%,P均＜0.01],而缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组则显著升高至(16.1±2.2)%,P＜0.01.正常组为(2.2±1.0)%.④各组ECV304细胞凋亡率:与缺氧6 h再灌注12 h对照组比较,缺氧6 h再灌注12 h中浓度清开灵组明显升高[(2.2±0.5),(1.5±0.4)%,P＜0.05];与正常组比较,缺氧24 h再灌注12 h对照组、缺氧24 h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高[(0.9±0.2),(5.5±2.5),(9.9±4.3)%,P均＜0.01];并且缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组比与缺氧24 h再灌注12 h对照组升高更明显(P＜0.01).结论:①清开灵注射液对不同程度缺血再灌注损伤的ECV304细胞均有保护作用,但随着损伤程度的不同而表现为两种相反的保护形式.②对于缺血6 h再灌注12 h此类受损伤较轻的ECV304细胞,主要表现为降低细胞的凋亡率;而对于缺血24 h再灌注12 h此类缺血再灌注损伤较重的ECV304细胞,则增加细胞的凋亡率,使坏死的细胞减少.③与坏死细胞相比,凋亡细胞不发生溶酶体、线粒体及胞膜的破裂,没有内涵物的外泄,故不引起周围细胞的次级损伤,从而提高了细胞存活率,起到保护大多数细胞的作用.     

缺血缺氧再灌注不同损伤程度人脐静脉内皮细胞变化与清开灵的干预效应

背景：“毒损脑络”是急性脑血管病的主要病机，以脑微血管损伤为主要表现。目的：建立不同缺氧缺血再灌注时间的细胞模型及施加药物干预，观察清开灵注射液对不同损伤程度人脐静脉内皮细胞ECV304的保护作用。设计：以培养的细胞为观察对象的随机对照实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科。材料：实验于2002—02／04在北京中医药大学附属东直门医院中心实验室完成。实验用人脐静脉内皮细胞ECV304随机分为7组，即正常组、缺氧6h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组、缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组。清开灵注射液主要成分为牛胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子总苷等。方法：缺血再灌注模型的制作：①从培养箱中取出培养的细胞，缺氧6h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h对照组分别吸除原培养液，换人无糖Earle’s液，细胞放人缺氧槽中37℃缺血缺氧培养。缺氧6h再灌注12h对照组培养6h，缺氧24h再灌注12h对照组培养24h后，分别吸去无糖Earle’s液，换人无血清1640液后置于37℃ CO2培养箱中再灌注培养12h。（2）缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组分别在缺氧24h再灌注12h对照组造模的基础上，向各自培养液中加人质量浓度为5，10，20mg／L的清开灵对细胞进行培养。⑧缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组在缺氧6h再灌注12h对照组造模的基础上，向培养液中加人质量浓度为10mg／L的清开灵。④细胞存活率以四唑盐比色试验测定，乳酸脱氢酶漏出率用乳酸脱氢酶试剂盒测定，细胞凋亡率行碘化吡啶染色后用流式细胞仪检测，Cellquest软件进行分析。主要观察指标：①细胞形态学观察结果。②各组细胞存活率、乳酸脱氢酶漏出率及细胞凋亡率。结果：①细胞形态学观察：正常组细胞密集，贴壁良好，伸展充分，细胞表面光滑，有较多的分裂期细胞，细胞长满底面，呈典型的“铺路石征”；缺氧6h再灌注12h对照组及缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组细胞形态改变不明显；缺氧24h再灌注12h对照组细胞较稀疏。脱壁较多，可见大量肿胀变圆的损伤细胞及破碎细胞的碎片，贴壁细胞皱缩明显，可见伪足，分裂期细胞少；缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组细胞贴壁良好，表面光滑，未发生皱缩，可见分裂期细胞。（④各组ECV304细胞存活率：与缺氧24h再灌注12h对照组比较，缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高[（42．5&;#177;2．8），（72．9&;#177;8．0），（80．3&;#177;12．7）％，P均（0．01]，而缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组则显著下降至（10．1&;#177;0．4）％，P（0．01。正常组为100％。⑧各组ECV304细胞乳酸脱氢酶漏出率：与缺氧24h再灌注12h对照组比较，缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高[（6．6&;#177;1．4），（2．4&;#177;1．4），（2．4&;#177;0．5）％，P均（0．01]，而缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组则显著升高至（16．1&;#177;2．2）％，P〈0．01。正常组为（2．2&;#177;1．0）％。④各组ECV304细胞凋亡率：与缺氧6h再灌注12h对照组比较，缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组明显升高[（2．2&;#177;0．5），（1．5&;#177;0．4）％，P〈0．05]；与正常组比较，缺氧24h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高[（0．9&;#177;0．2），（5．5&;#177;2．5），（9．9&;#177;4．3）％，P均（0．01]；并且缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组比与缺氧24h再灌注12h对照组升高更明显（P（0．01）。结论：①清开灵注射液对不同程度缺血再灌注损伤的ECV304细胞均有保护作用，但随着损伤程度的不同而表现为两种相反的保护形式。②对于缺血6h再灌注12h此类受损伤较轻的ECV304细胞，主要表现为降低细胞的凋亡率；而对于缺血24h再灌注12h此类缺血再灌注损伤较重的ECV304细胞，则增加细胞的凋亡率，使坏死的细胞减少。⑧与坏死细胞相比，凋亡细胞不发生溶酶体、线粒体及胞膜的破裂，没有内涵物的外泄，故不引起周围细胞的次级损伤，从而提高了细胞存活率，起到保护大多数细胞的作用。     

碱性成纤维细胞生长因子及WTp53在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的作用

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的作用及其机制。方法:随机将28只大鼠分为正常组和手术组,其中手术组大鼠左眼为缺血再灌注组,右眼为治疗组(玻璃体腔内注射bFGF),观察再灌注后不同时间段1,6,12,24,48,72h视网膜组织中细胞凋亡情况及WTp53的表达变化。前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型。应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法检测视网膜组织中凋亡细胞数,免疫组织化学SABC法检测视网膜组织中WTp53蛋白的表达。结果:视网膜神经细胞的凋亡出现于再灌注后6h,并逐渐递增,24h达到高峰,48h开始下降,72h组不明显。WTp53蛋白表达改变与凋亡的神经细胞改变基本一致。治疗组各观察指标表达变化规律与缺血再灌注组基本一致,但凋亡细胞数目在6～48h犤6,12,24,48h分别为(358.3±43.4),(859.5±12.0),(1006.5±49.4),(695.7±72.2)个/mm2犦明显低于缺血再灌注组犤(444.8±89.7),(1053.0±96.1),(1254.0±164.8),(891.0±87.2)个/mm2犦(t=2.9131～4.299,P均<0.05);WTp53表达在6～48h缺血再灌注组显著下降(t=3.342～4.781,P<0.05;t=52.586,P<0.01)。结论:WTp53参与视网膜缺血-灌注损伤,促进神经节细胞的凋亡;bFG     

全脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元凋亡:调节蛋白Bcl-2和Bax的表达(英文)

背景:脑缺血再灌注对中枢神经系统的影响,除了急性期的细胞坏死,还有迟发性的神经元凋亡。目的:观察大鼠全脑缺血不同再灌注阶段海马神经元凋亡率、坏死率及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的表达情况,并探讨其对全脑缺血再灌注损伤的调节作用。设计:随机对照实验。单位:首都医科大学附属北京天坛医院的神经外科和麻醉科。材料:实验于2003-01/2004-01在首都医科大学附属北京神经外科研究所完成。选择清洁级成年雄性健康Wistar大鼠33只,随机分5组,缺血再灌注24h组7只、缺血再灌注48h组7只、缺血再灌注72h组7只、缺血再灌注7d组7只和假手术对照组5只。干预:制备大鼠全脑缺血再灌注模型。分别于再灌注24,48,72h和7d取脑海马组织,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,坏死率,Bcl-2和Bax蛋白在大鼠脑海马神经元中的表达情况。主要观察指标:①流式细胞仪检测各组大鼠脑海马组织细胞凋亡率和坏死率。②Bcl-2和Bax蛋白表达百分率。结果:33只大鼠全部进入结果分析。①缺血再灌注7d组海马神经元的凋亡率最高犤(24.59±0.97)%犦,坏死率峰值出现在缺血再灌注24h组犤(16.67±1.04)%犦,明显高于假手术对照组犤(1.28±0.50)%,(0.90±0.38)%犦(P<0.01)。②假手术对照组Bcl-2表达极低犤(1.07±0.27)%犦,但Bax有高表达犤(46.09±5.37)%犦。③Bcl-2蛋白峰值出现在缺血再灌注后48h犤(14.41±0.67)%犦,而Bax蛋白峰值出现在缺血再灌注之后72h犤(77.38±1.52)%犦。结论:全脑缺血再灌注损伤后海马神经元凋亡率逐渐增高,凋亡调控基因Bcl-2和Bax表达异常增高,提示Bcl-2和Bax蛋白参与了全脑缺血再灌注损伤的凋亡调节。     

诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤及骨细胞凋亡中的作用

目的观察兔膝关节软骨缺血再灌注损伤过程中诱导型一氧化氮合酶的表达规律及软骨细胞的凋亡情况,探讨诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤中的作用.方法实验于2004-03/09在泰山医学院形态学研究室完成.①选择健康新西兰白兔45只,随机分为假手术组5只,暴露股动静脉但不阻断血运,术后4 h取材;缺血组5只,缺血4 h不恢复血运即取材;缺血再灌注组35只,阻断股动静脉4 h后恢复血运,于缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d取材,每时点各5只.②采用免疫荧光法测定软骨内诱导型一氧化氮合酶的表达阳性细胞,染色成功后用激光共聚焦显微镜观察并扫描记录.阳性细胞标记为红色荧光.③采用原位末端标记法测定凋亡软骨细胞数目,染色成功后在显微镜下观察并记数.细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞.结果纳入动物45只,均进入结果分析.①缺血再灌注组诱导型一氧化氮合酶阳性细胞数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d分别为0,(1.20±0.40),(22.20±1.30),(33.00±1.58),(40.00±1.58),(33.80±1.30),(18.20±1.48),(11.20±1.67),(3.00±1.00)个/mm2,P＜0.01].②缺血再灌注组软骨细胞凋亡数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d分别为[(0.50±0.40),(1.20±0.45),(7.80±1.30),(12.60±1.14),(16.60±1.12),(17.80±1.30),(15.20±0.87),(13.60±0.89),(4.40±1.67)个/mm2,P＜0.01].③诱导型一氧化氮合酶的表达与软骨细胞凋亡数高度相关(r=0.716,P=0.046).结论诱导型一氧化氮合酶参与了软骨缺血再灌注损伤,并可能是触发软骨细胞凋亡的重要因素.     

改构型酸性成纤维细胞生长因子对肠缺血-再灌注的保护作用

目的 观察改构型酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)对大鼠肠缺血-再灌注所致肠道损伤的 保护作用。方法 用夹闭肠系膜上动脉(SMA)造成肠缺血45 min、松夹形成缺血-再灌注的方法制备肠缺 血-再灌注损伤模型。生理盐水对照组和rhaFGF治疗组于再灌注即刻分别经静脉注射生理盐水0.1 ml和 rhaFGF 4 μg。缺血一再灌注后2、6、12和24 h取血及小肠组织,分别测定D一乳酸含量,观察小肠组织学改变; 用末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术(TUNEL)检测肠道细胞凋亡率,并与假手 术组比较。结果 缺血-再灌注6 h生理盐水对照组D-乳酸含量较假手术组明显升高,达到(0.34± 0.09)mg／L.rhaFGF治疗组为(0.23±0.07)mg／L(P均<0.05)。组织学检查显示,缺血-再灌注2~24 h生 理盐水对照组肠道损伤严重,rhaFGF治疗组肠道损伤有所减轻。细胞凋亡检测显示,假手术组肠道细胞凋亡 率很低;随着缺血-再灌注损伤时间的延长,生理盐水对照组和rhaFGF治疗组细胞凋亡率均明显升高,于缺 血-再灌注12 h达峰值[生理盐水对照组细胞凋亡率高达(62.8±1.7)％,而rhaFGF治疗组为(42.5± 2.6)％]后均呈下降趋势,两者各时间点均有统计学差异(P均<0.05)。结论rhaFGF能降低大鼠肠缺血-再 灌注所致的血浆D-乳酸含量和肠道细胞凋亡率,提     

电针对缺血再灌注大鼠脑内小胶质细胞活化的影响

目的:观察局灶性脑缺血再灌注对大鼠脑内小胶质细胞活化的影响以及电针刺激水沟、百会(的调节作用。方法:实验于2002-03在华中科技大学同济医学院组织胚胎学教研室完成。取80只Wistar大鼠随机分为8组,每组10只:①正常对照组:不干预,次日处死。②假手术组:仅分离动脉,不插线栓,次日处死。③再灌注6,12,24h组:线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型,缺血30min后分别再灌注6,12,24h处死。④再灌注6h+电针组:同前造模,在栓线插入大脑中动脉造模成功后立即进行针刺(水沟、百会),加电刺激(疏密波,频率4Hz/16Hz,刺激强度从1V起,每10min增加1V,终强度为3V,每次持续刺激30min),缺血30min后再灌注6h处死。⑤再灌注12h+电针组:造模后立即针刺,隔8h后再针刺1次,参数同前。缺血30min后再灌注12h处死。再灌注24h+电针组:造模后立即针刺1次,每隔8h针刺1次,缺血30min后再灌注24h处死。切片组织采用免疫组织化学法以蓖麻凝集素标记小胶质细胞,计算小胶质细胞数量。结果:67只大鼠进入结果分析。正常对照组和假手术组未见显色,再灌注6,12,24h组在缺血灶边缘可见大量小胶质细胞活化,数量增加,再灌注12h达高峰,分别为(35.38±1.77),(54.25±1.67),(49.29±2.21)个/200倍视野;经电针治疗后,再灌注6,12,24h+电针组均低于同时段模型组[(32.11±2.80),(50.88±2.64),(45.45±3.95)个/200倍视野,P<0.05]。结论:脑缺血再灌注后脑内小胶质细胞被活化,对神经元产生毒性作用。电针治疗可减少小胶质细胞活化,从而对神经元发挥保护作用。     

肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注中的表达及对神经细胞凋亡的影响

目的:观察大鼠脑缺血再灌注损伤后肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)表达及细胞凋亡情况,探讨TNF-α在脑缺血再灌注损伤中的作用。方法:采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,分为3组:脑缺血再灌注组大鼠大脑中动脉阻塞2h,再灌注2,6,12,24,48,72,96h、假手术组及永久缺血组,分别测定TNF-α表达(用免疫组织化学法)及细胞凋亡数(原位凋亡检测试剂盒)。结果:脑缺血再灌注组TNF-α表达水平犤6h:(15.0±3.21)个/mm2,12h:(47.0±0.87)个/mm2,24h:(49.0±10.3)个/mm2,48h:(44.8±6.9)个/mm2,96h:(37.9±6.4)个/mm2犦、细胞凋亡数犤2h:(33.3±0.8)个/mm2,6h:(56.6±1.6)个/mm2,12h:(72.3±4.2)个/mm2,24h:(86.6±5.5)个/mm2,48h:(96.8±0.9)个/mm2犦明显高于假手术组(P<0.01)及永久缺血组(P<0.05);且TNF-α表达与细胞凋亡数关系密切(r=0.567,P<0.01)。结论:大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-α在神经元迟发性坏死中起着重要作用。     

局灶脑缺血再灌注期亚低温对神经元凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响

目的:研究再灌注期实施亚低温治疗对大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)后神经元细胞的凋亡及Bcl-2,Bax基因表达的影响。方法:采用Longa线栓法制作MCAO模型,模型成功后分别进行缺血期3h、再灌注期3h、缺血期至再灌注期6h的亚低温治疗。再灌注后24h断头取脑,连续切片作TUNEL染色及Bcl-2,Bax免疫组化染色。结果:①与对照组的Bcl-2阳性细胞百分率犤(19.79±0.92)%犦相比,缺血期亚低温3h组犤(23.04±3.76)%犦和缺血亚低温至再灌亚低温6h组犤(25.47±2.03)%犦的Bcl-2阳性细胞率增加(q=4.19,0.010.05)。③凋亡细胞阳性率与Bcl-2/Bax的比值呈负相关关系(r=-0.9759,P<0.01)。结论:①单纯于再灌注期实施亚低温3h不能明显抑制神经元细胞凋亡,对Bcl-2和Bax基因的表达也     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑细胞内游离钙变化的影响(英文)

背景:碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的神经元存活及突起生长,拮抗兴奋性氨基酸毒性,对中枢神经系统功能恢复起重要作用,能否通过影响脑细胞内游离钙离子浓度对缺血脑组织起保护作用。目的:从细胞水平探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时神经细胞内游离Ca2+浓度变化的影响。设计:完全随机对照实验。单位:郑州大学第二附属医院神经内科。材料:实验于2003-08/12在郑州大学第二附属医院神经内科实验室完成。24只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和碱性成纤维细胞生长因子治疗组,每组8只。方法:缺血再灌注组及碱性成纤维细胞生长因子治疗组采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型;假手术组除不插线外,余同其他两组。碱性成纤维细胞生长因子治疗组于缺血后即刻腹腔注射10μg/kg碱性成纤维细胞生长因子,其余两组腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠于缺血再灌注24h检测脑细胞游离钙浓度。主要观察指标:各组大鼠缺血再灌注24h脑细胞游离钙浓度。结果:24只大鼠全部进入结果分析。缺血再灌注组明显高于假手术组犤(673.46±18.44),(224.71±10.58)nmol/L,(F=1329.06,P<0.01)犦,碱性成纤维细胞生长因子治疗组明显低于缺血再灌注组犤(378.37±21.08),(673.46±18.44)nmol/L(F=1329.06,P<0.01)犦。结论:碱性成纤维细胞生长因子能明显抑制大鼠缺血再灌注后脑组织内游离钙水平,起到稳定细胞膜,防止细胞内钙超载的作用。     

外源性雌二醇对脑缺血再灌注损伤大鼠脑源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响

目的:观察雌二醇对脑缺血再灌注损伤后具有脑缺血神经元保护作用的脑源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响。方法:实验于2002-06/10在郑州大学第一附属医院病理科重点实验室进行。将72只Wistar大鼠随机分为3组:①假手术组(n=8),腹腔注射消毒后的精制玉米油1.5mL,1次/d,连续7d,然后手术,仅分离血管,不栓塞。②模型组(n=32):给药同假手术组,然后采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。③雌二醇组(n=32):将17β-雌二醇溶于玉米油中,按100μg/kg腹腔注射,1次/d,连续7d,然后同前造模。假手术组于术后6h,其他两组于再灌注3,6,12,24h处死动物取材(每个时间点8只),采用连续切片免疫组化法检测各组大鼠脑皮质和纹状体区脑源性神经营养因子核神经生长因子表达,以及脑源性神经营养因子神经纤维有无染色。结果:经补充后72只大鼠进入结果分析。①脑源性神经营养因子阳性细胞数:脑皮质:再灌注后6h雌二醇组高于假手术组,但与模型组比较无差异犤(78.88±6.03),(53.75±3.92),(76.75±5.87)个/视野犦,再灌注12h雌二醇组显著高于模型组犤(86.50±4.24),(63.13±7.72)个/视野,P<0.01犦。脑纹状体:再灌注6h雌二醇组高于假手术组,但与模型组比较无差异犤(63.88±5.37),(38.75±4.17),(61.63±6.39)个/视野犦,再灌注12h雌二醇组显著高于模型组犤(71.38±5.29),(48.00±8.32)个/视野,P<0.01犦。②神经生长因子阳性细胞数:皮质:再灌注6h雌二醇组高于于假手术组犤(71.50±4.50),(45.75±7.03)个/视野,P<0.01犦,至再灌注12h,显著高于模型组犤(79.20±6.39),(58.63±4.81)个/视野,P<0.01犦,再灌注24h,仍高于模型组犤(69.00±4.96),(49.25±5.80)个/视野,P<0.01犦。脑纹状体:3组均为少量表达。③脑源性神经营养因子神经纤维阳性密度:雌二醇组显著高于其他两组(χ2=19.015,25.6,P<0.01)。结论:给予外源性的雌二醇可以使脑缺血再灌注后内源性脑源性神经营养因子、神经生长因子表达上调,且在再灌注12h内,使大脑半球免于损伤,达到脑保护治疗的作用。     

LPA2在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中的作用

目的探讨溶血磷脂酸(LPA)2受体在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中的作用。方法以实验方法完成研究,通过建立PC12细胞缺血再灌注受损细胞模型,分别于缺氧环境中培养0、3、6、9、12、15h以进行糖氧剥夺,之后再将其放入高糖培养基中再次复氧培养24h,然后利用MTT来检测细胞存活率,并对其进行分组,分为正常组、缺血再灌注组(A组)、缺血再灌注+溶剂对照组(B组)、缺血再灌注+LPA2激动剂组(C组)、缺血再灌注+LPA2抑制剂组(D组)。先进行缺氧培养一定时间后再复氧培养24h,并采用MTT检测细胞存活率,同时,检测LPA2受体与P-akt蛋白的表达情况。结果经糖氧剥夺培养6h后,缺血再灌注的细胞存活率较正常组明显下降,差异有统计学意义(P0.05),且缺血再灌注损伤糖氧剥脱处理最适时间为12h。A组LPA2表达水平明显低于B组;C组与B组相比较,LPA2表达水平显著增高,且P-akt表达水平显著增高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 LPA2受体在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中起着重要的保护作用,且升高LPA2受体表达水平有助于提高细胞生存率。     

鼻腔给予外源性胰岛素样生长因子后成年大鼠脑梗死体积及Bcl-2蛋白表达的变化

目的:观察经鼻腔给予外源性胰岛素样生长因子对成年大鼠局灶性脑缺血后脑梗死体积及凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达的影响。方法:实验于2003-12/2004-05在中国医科大学动物实验室进行,取70只雄性SD大鼠随机分为4组:①正常组(n=5):不干预。②假手术组(n=5):只分离颈总动脉及颈外动脉,不插入尼龙线。③缺血组(n=30):采用线栓法制备大鼠持续性局灶性脑缺血模型,缺血后0.5h经鼻腔给予生理盐水5μL,间隔2min后再次给药,共10次50μL。缺血后24,48,72,96,120h,7d麻醉状态下处死动物。④胰岛素样生长因子组(n=30):造模同模型组,缺血后0.5h经鼻腔滴注胰岛素样生长因子50μL,给药方法和处死时间同模型组。计算各组不同时间点脑梗死灶体积、Bcl-2阳性细胞数用免疫组化方法测定。结果:经补充后70只大鼠进入结果分析。①脑梗死灶体积:缺血组24,72h最大,120h变小,7d更小犤(283.72±40.58),(288.74±42.03),(141.97±28.34),(101.28±19.42)mm3犦,胰岛素样生长因子组以上各个时间点均小于缺血组犤(202±32.66),(200.83±36.80),(98.97±32.76),(78.92±23.24)mm3,P<0.01犦。②Bcl-2阳性细胞数:正常组及假手术组未见,缺血组24h少量出现,72h达高峰,120h减少,7d更少犤(9±3),(28±3),(17±2),(3±3)个/视野犦,胰岛素样生长因子组以上各个时间点均多于缺血组犤(22±3),(37±6),(26±4),(8±3)个/视野,P<0.01犦。结论:脑缺血后经鼻腔给予胰岛素样生长因子能减少模型大鼠脑梗死灶体积,上调Bcl-2蛋白表达,抑制细胞凋亡,起到脑保护作用。     

大鼠脑组织缺血再灌注后促红细胞生成素对神经元的保护

目的:观察促红细胞生成素对缺血再灌注大鼠脑组织海马CA1区神经元数量、凋亡细胞数量变化、脑组织匀浆一氧化氮含量、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性改变的影响。方法:实验于2003-03/2004-12在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室完成。选择健康Wistar大鼠66只,随机分为正常对照组6只,缺血再灌注生理盐水组30只(生理盐水对照组),缺血再灌注促红细胞生成素组30只(促红细胞生成素治疗组)。除正常对照组线栓法制备大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型,缺血2h后再灌注。促红细胞生成素组于再灌注开始时经腹腔按2000U/kg注入生理盐水稀释的重组人红细胞生成素(200U/mL),生理盐水对照组经腹腔注入等量的生理盐水。再灌注后观察时相点为2,6,12,24,48h,每个时间点6只。应用苏木精-伊红染色观察脑海马CA1区细胞数量情况,应用末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记法检测海马CA1区神经元凋亡情况,应用硝酸还原酶法测定脑组织一氧化氮含量,羟胺法测定脑组织超氧化物歧化酶活性,硫代巴比妥酸法测定脑组织中丙二醛含量。结果:66只大鼠全部进入结果分析。①脑海马CA1区细胞计数:促红细胞生成素治疗组再灌注后12,24,48h比生理盐水对照组细胞数明显增加犤(286.7±33.8),(268.6±44.5)个/视野;(271.9±30.4),(240.8±22.5)     

胰岛素对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及其相应基因的调控

目的观察胰岛素(insulin,RI)对缺血再灌注损伤后细胞凋亡及其相应基因的调控作用,评估RI对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法将健康wistar大鼠56只,随机分为对照组、缺血再灌注盐水组(NS)、缺血再灌注胰岛素组(RI)。采用pulsinelli4血管阻塞模型,观察RI、NS在4,24,48h海马CA1区存活神经元数目,TUNEL阳性细胞数目,Bcl-2蛋白的表达,以观察比较缺血再灌注阶段细胞凋亡的变化。结果再灌注NS组CA1区神经元数目(36±6)个/mm2较再灌注RI组(88±9)个/mm2少(t=3.34,P<0.01)。再灌注后CA1区细胞凋亡数:4h时再灌注NS组(12±3)个/mm2高于再灌注RI(8±1)个/mm2和假手术组(2±1)个/mm2:组间比较,F=127.66,P<0.001。Bcl-2对海马CA1细胞凋亡评估4h时,再灌注NS组43.0±9.8,高于再灌注RI组24.0±5.4和假手术组2.7±0.8。结论全脑缺血再灌注时急用RI可减轻脑缺血再灌注神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤引起的神经元延迟性坏死有保护作用。     

蛋白激酶C活化对大鼠缺血再灌注心肌细胞核三磷酸肌醇受体结合活性的影响

目的:观察具有抑制心肌细胞凋亡作用的蛋白激酶C活化对缺血再灌注心肌细胞核三磷酸肌醇受体结合活性的影响,以探讨其对心肌的保护作用。方法:实验于2003-04/07在解放军第三军医大学药理教研室完成。选用SD健康大鼠12只。随机分为2组,缺血再灌注组及假手术对照组,每组6只。缺血再灌注组:冠状动脉结扎30min,再灌注3h。假手术对照组:只埋线不结扎冠状动脉。采用蔗糖密度梯度离心法提纯心肌细胞核,将分离纯化的两组心肌细胞核分别平等进行2个亚组:磷酸化组和非磷酸化组,磷酸化组进行蛋白激酶C激动剂12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13磷酸化干预后,与非磷酸化组同时进行氚-1,4,5三磷酸肌醇的放射受体分析,比较两组细胞核经磷酸化后细胞核三磷酸肌醇受体结合活性变化。结果:进入结果分析大鼠12只。①心肌细胞凋亡指数:缺血再灌注组明显高于假手术对照组(9.88±0.33,0.6±0.0,P<0.01)。②大鼠心肌细胞核膜三磷酸肌醇受体的结合活性:缺血再灌注组与磷酸化组明显低于非磷酸化组犤(88.27±0.08),(136.05±0.05)pmol/g,P<0.05犦。③大鼠心肌细胞核膜三磷酸肌醇受体的结合力:磷酸化组和非磷酸化组无明显差异犤(102.83±0.09),(106.24±0.26)pmol/g,P>0.05犦。结论:大鼠心肌缺血再灌注时,蛋白激酶C可能是通过抑制心肌细胞核膜三磷酸肌醇受体的结合活性,进而参与了抑制缺血再灌注性心肌细胞凋亡的发生与发展。     

钙预适应对缺血再灌注心肌细胞的保护作用

目的:从细胞水平研究钙预适应对培养心肌细胞的缺血再灌注损伤是否具有保护作用。方法:实验选用3日龄健康清洁级SD乳鼠15只,雌雄不限,体质量10～15g。体外分离培养SD乳鼠心肌细胞,以模拟缺血溶液和模拟再灌注溶液模拟体内缺血再灌注过程,将培养心肌细胞随机分别用正常对照组、缺血再灌注组、钙适应缺血再灌注组,实验结束后检测心肌细胞活性、培养基乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)水平和心肌细胞凋亡。结果:模拟缺血再灌注可引起明显的心肌细胞损伤,无钙复钙可明显减少模拟缺血再灌注对心肌细胞的损伤,钙适应缺血再灌注组细胞的台盼蓝摄取率、LDH活性、凋亡指数犤(6.2±1.2)%,(1592.0±111.7)μkat/L,(6.2±0.4)%犦均明显低于缺血再灌注组犤(24.6±1.8)%,(2873.9±43.3)μkat/L,(10.6±0.6)%犦(t=19.02,23.92,13.64,P<0.01)。结论:在细胞水平上证实了无钙复钙预适应对缺血再灌注心肌细胞有明显的保护作用。     

大剂量硝酸甘油对大鼠离体缺血再灌注心肌细胞凋亡和Bax及Bcl-2的影响

目的:研究硝酸甘油是否对大鼠离体缺血再灌注心肌细胞凋亡和Bcl-2/Bax水平存在直接的影响。方法:实验选用SD大鼠30只,随机分为硝酸甘油组和对照组,每组15只。制备大鼠离体心肌缺血再灌注模型(缺血30min,再灌注120min)在再灌注开始时分别给以大剂量硝酸甘油(15μg/h,以950mL/L乙醇为溶剂)或950mL/L乙醇(3μL/h)。再灌注结束后,将缺血区剪下,制备石蜡切片,采用TUNEL技术检测心肌凋亡,免疫组化技术检测心肌组织的Bcl-2和Bax水平。结果:硝酸甘油组细胞发生凋亡数犤(35.2±6.7)%犦明显多于对照组细胞犤(5.2±0.8)%犦(t=28.1,P<0.01)。对照组Bcl-2表达(5.7±1.3)明显强于硝酸甘油组(1.8±0.8)(t=11.9,P<0.01)。对照组Bax表达(5.9±1.3)明显弱于硝酸甘油组(9.1±1.3)(t=9.2,P<0.01)。结论:大剂量的硝酸甘油促进了大鼠离体缺血/再灌注心肌细胞凋亡,提高了Bax蛋白的水平,降低了Bcl-2蛋白水平;大剂量硝酸甘油对Bcl-2/Bax的调节可能是其促凋亡的主要机制之一。     

参附注射液对大鼠肠缺血再灌注损伤和修复时肠上皮细胞的保护作用

背景:细胞凋亡在肠缺血再灌注损伤和修复中起主要作用,参附注射液对肠缺血再灌注时肠上皮细胞凋亡的影响有待观察。目的:分析肠上皮细胞凋亡与肠缺血再灌注损伤和修复特征的关系。设计:随机对照动物实验。单位:湖北省咸宁市中心医院普外科及武汉大学人民医院普外科。材料:实验于2005-03/08在咸宁市中心医院中心实验室完成,选择54只健康雄性大鼠,体质量200～250g,购自武汉大学医学院动物实验中心。方法:随机摸球法将大鼠分为对照组6只,肠缺血再灌注组24只及参附处理组24只。①麻醉大鼠,分离其肠系膜上动脉,肠缺血再灌注组、参附处理组用无损伤血管夹阻断肠系膜上动脉血流1h,再灌注1,24,72h,参附处理组于阻断前30min经静脉输注参附注射液8mL/(kg·h),20mL/(kg·d),由人参和黑付子组成(雅安三九药液公司,批号:030302)。对照组不阻断肠系膜上动脉血流,对照组与肠缺血再灌注组于阻断前30min经静脉输注等量生理盐水,整个实验过程对大鼠进行面罩给氧。②肠缺血再灌注组和参附处理组分别于缺血后1h、再灌注1,24,72h取材,对照组于造模后取材,每组各6只。观察各组大鼠肠黏膜组织病理学改变(采用下列评分系统:0分,绒毛和腺体正常;1分部分绒毛顶端上皮轻度受损;2分,上皮下腺体轻度受损;3分,上皮下间隙扩大,毛细血管充血;4分,上皮与固有层中度分离,腺体受损;5分,部分绒毛顶端脱落;6分,绒毛明显脱落;7分,固有层绒毛脱落;8分,固有层开始消化分解;9分,出血、溃疡形成)和有丝分裂活性。③采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口未端标记实验结合激光共聚焦显微镜观察小肠黏膜上皮细胞凋亡情况,测定细胞凋亡指数,即每张切片随机取10个高位视野,每100个细胞中凋亡阳性细胞数。④在苏木精-伊红染色的肠黏膜上皮细胞间观察有丝分裂相,10个相邻肠黏膜上皮细胞间具有有丝分裂相的细胞数作为有丝分裂活性指数。主要观察指标:各组大鼠组肠黏膜组织病理学改变,细胞凋亡指数和有丝分裂活性的测定。结果:纳入大鼠54只全部进入结果分析。①参附处理组大鼠肠缺血1h、再灌注1,24h黏膜组织病理学改变评分分别为[(0.65±0.35),(3.87±0.86),(0.65±0.35)分,低于肠缺血-再灌注组[(7.11±1.01),(8.05±1.34),(1.53±0.48)分,P<0.05]。②参附处理组大鼠肠缺血1h、再灌注1,24,72h黏膜上皮细胞凋亡指数分别为(17.24±7.05),(24.20±9.87),(11.49±4.71),(6.02±2.16)个,低于肠缺血-再灌注组[(51.09±13.76),(54.89±15.58),(23.54±9.64),(12.47±5.52)个,P<0.05],缺血1h、再灌注1h有丝分裂活性分别为(10.37±2.03),(11.72±2.07)个,高于肠缺血-再灌注组[(8.24±1.69),(9.95±1.93)个,P<0.05]。结论:参附注射液能够降低肠黏膜上皮细胞凋亡,并增强肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性,从而促进肠黏膜损伤的修复。     

参附注射液对再灌注期间肠黏膜上皮细胞凋亡的抑制

背景肠上皮细胞异常凋亡是缺血再灌注期间肠黏膜损伤的主要原因,参附注射液对小肠黏膜损伤有良好的防治作用.目的建立大鼠肠缺血再灌注模型,观察缺血再灌注时给予参附注射液对肠上皮细胞凋亡数目、凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bcl-2的表达及肿瘤坏死因子水平的影响.设计随机对照实验.单位武汉大学人民医院麻醉科.材料实验于2002-12/2003-06在武汉大学人民医院麻醉科实验室完成.选取健康清洁级SD大鼠24只,随机分为空白对照组、肠缺血再灌注组、参附注射液组,8只/组.方法各组大鼠给予氨基甲酸乙酯1 mg/kg腹腔注射麻醉,肠缺血再灌注组和参附注射液组用血管钳夹闭肠系膜上动脉1 h然后再灌注2 h,空白对照组不用血管钳夹闭肠系膜上动脉.参附注射液组于阻断前30 min静注参附注射液0.02 mL/g,空白对照组和肠缺血再灌注组静脉输注等量生理盐水.制备切片进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bcl-2蛋白的表达及细胞凋亡检测.主要观察指标①各组大鼠细胞凋亡指数的比较.②各组大鼠肠上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及Bcl-2基因的表达.③各组肠粘膜匀浆中肿瘤坏死因子含量的比较.结果实验选用24只大鼠,全部进入结果分析.①各组大鼠细胞凋亡指数的比较参附注射液组的凋亡指数明显低于肠缺血再灌注组,但比空白对照组高[(7.75±1.89)%,(28.25±8.50)%,(4.25±2.63)%,P均＜0.01].②各组大鼠肠上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及Bcl-2基因的表达参附注射液组组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达低于肠缺血再灌注组,但高于空白对照组[(0.211 6±0.087 5),(0.354 7±0.077 8),(0.194 1±0.057 4),P＜0.01,P＞0.05];Bcl-2的表达在肠缺血再灌注组比空白对照组显著增高(P＜0.05),参附注射液组的表达比肠缺血再灌注组明显降低(P＜0.01).③各组肠黏膜匀浆中肿瘤坏死因子含量的比较砀缺血再灌注组肿瘤坏死因子的表达显著高于空白对照组和参附注射液组[(189.7±56.3),(38.6±10.4),(47.5±18.7)mg/L,P均＜0.01],参附注射液组和空白对照组基本相似(P＞0.05).结论参附注射液通过抑制肿瘤坏死因子的含量、降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达、上调Bcl-2基因而抑制缺血再灌注期间肠黏膜上皮细胞的凋亡,从而减轻肠黏膜缺血再灌注损伤.